نمونه سوالات استخدامی بهداشت محیط
آیین‌کار آزمون‌های باکتریولوژیکی آب - سایت بهداشت محیط ایران
سایت بهداشت محیط ایران
بهداشت محیط،آب وفاضلاب، مواد زائد ، بهداشت مواد غذایی،استخدامی بهداشت محیط

آیین‌کار آزمون‌های باکتریولوژیکی آب

آیین‌کار آزمون‌های باکتریولوژیکی آب

  1- هدف

 هدف از تدوین این آئین‏کار , ارائه یک راهنما 1 جهت انجام آزمون‏های باکتریولوژیکی آب می‏باشد            

 این آئین کار شامل آماده سازی نمونه

 و روش‏های مختلف شمارش انواع میکروارگانیسم‏هاست .

  2- دامنه کاربرد

 این آئین‏کار در مورد آب آشامیدنی , آب معدنی بطری شده , آب استخر و شناگاههای طبیعی کاربرد دارد .

- مواد اولیه

 به منظور بدست آوردن نتایج هماهنگ , لازم است از مواد اولیه‏ای با کیفیت و درجه خلوص یکسان , استفاده نمود آب مورد مصرف نیز باید از نوع تقطیر شده با تجهیزات شیشه‏ای 2 بوده و عاری از مواد بازدارنده از رشد میکروارگانیسم‏ها باشد . در صورتی که آب مقطر از آب کلرینه شده تهیه می‏شود باید قبل از تقطیر ; کلر آن خنثی شود .

3-2- محیط کشت - برای آماده کردن محیطهای کشت دستورالعمل سازنده باید به طور دقیق رعایت شود . بسیاری از محیطهای کشت را می‏توان پس از سترون شدن به صورت کاملا دربسته در دمای 22-18 درجه سلسیوس به مدت حداکثر 3 ماه نگه داری نمود . محیطهائی که تحت شرایط سترونی تقسیم و توزیع می‏شوند را می‏توان در دمای 10-4 درجه سلسیوس حداکثر به مدت یک ماه نگه‏داری نمود . کلیه محیطهای کشت باید قبل از مصرف از نظر آلودگی , تبخیر زیاد و یا سایر نشانه‏های فساد کنترل شوند .

- سترونی

 4-1- محیطهای کشت و محلول‏های رقیق کننده - در اغلب موارد محیطها و محلول‏های رقیق کننده پس از توزیع در ظروف مناسب در دمای 121±1 درجه سلسیوس (فشار 245 کیلو پاسکال) به مدت 15 دقیقه سترون می‏شود . در مواردی خاص می‏توان طبق توصیه سازنده از دما و زمان مختلف استفاده نمود . در مورد محیطهائی که نسبت به حرارت ناپایدار هستند سترونی با استفاده از صافی‏های سترون با اندازه روزنه حداقل 0/22 میکرون انجام می‏شود .

 4-2- وسایل و تجهیزات - وسایل و تجهیزات فلزی , شیشه‏ای و یا سایر ترکیبات مقاوم به حرارت به وسیله یکی از روش‏های زیر سترون می‏شود .

 4-2-1- دمای خشک - در دمای 160±2 درجه سلسیوس به مدت حداقل 1/5 ساعت و یا در دمای 170±2 درجه سلسیوس به مدت حداقل یک ساعت . 2-4-2- دمای مرطوب - در دمای 121±1 درجه سلسیوس (فشار 245 کیلو پاسکال به مدت حداقل 20 بیست دقیقه .

آماده‏سازی نمونه

 به منظور توزیع یکنواخت میکروارگانیسم‏ها , باید قبل از آزمون نمونه را با تکان دادن ظرف , کاملا مخلوط نمود

. در صورتی که ظرف حاوی نمونه بصورت کامل پر می‏باشد , ابتدا مقداری از آن را تحت شرایط سترونی بیرون ریخته و سپس عمل مخلوط کردن را انجام دهید .

6- شمارش در محیط جامد

 روش براساس برداشت حجم معینی از نمونه و تلقیح آن بر روی سطح و یا درون محیط کشت خاصی است . فرض براین است که پس از گرمخانه‏گذاری هر میکروارگانیسم تکثیر یافته و ایجاد پرگنه قابل مشاهده در محیط کشت می‏کند

 . روش کار می‏تواند به سه صورت به شرح زیر باشد :

6-1- روش مخلوط کردن نمونه با محیط کشت درون پلیت - (پورپلیت) 4 روش براساس مخلوط کردن حجم معینی از نمونه و یا رقتی از آن با محیط ذوب شده تا دمای نزدیک به انجماد می‏باشد . پس از گرمخانه‏گذاری پرگنه‏های روی سطح محیط و یا درون آن شمارش می‏شود .

6-2- روش کشت سطحی - در این روش حجم معینی از نمونه یا رقتی از آن روی سطح محیط کشت حاوی آگار گسترده می‏شود و پس از گرمخانه‏گذاری کلیه پرگنه‏های روی سطح محیط شمارش می‏شود .

-3- روش صافی غشائی - روش براساس عبور دادن حجم معین نمونه از صافی است میکروارگانیسم‏ها روی صافی باقی می‏ماند سپس صافی روی محیط آگاردار و یا بالشتک جاذب 6 آغشته  به محیط مایع قرار می‏گیرد . پس از گرمخانه‏گذاری , پرگنه‏های روی سطح صافی‏ها شمارش می‏شود

. در مواردی که جستجوی میکروارگانیسم‏های بی هوازی موردنظر است , ابتدا صافی درون پلیت قرار می‏گیرد (به گونه‏ای که سطح چهارخانه آن به طرف پائین باشد). و سپس با محیط حاوی آگار ذوب شده پوشانیده می‏شود .

حداکثر حجم نمونه آزمایشی بستگی به قابلیت صاف شدن نمونه و صافی مورد استفاده دارد .

در مورد آب آشامیدنی حجم استاندارد برای صاف کردن نمونه 100/ میلی لیتر است . با صافی‏هائی با اندازه 0/45 میکرون

7 امکان صاف کردن چند لیتر آب وجود دارد که در این صورت روش آزمایش از حساسیت بالائی برخوردار است .

-3-2- انتقال صافی - پس از برداشتن صافی باکمک پنس سترون آن را به یک پلیت حاوی محیط آگار دار منتقل میکنیم

- گرمخانه گذاری

 کلیه پلیت‏ها را به صورت وارونه درون گرمخانه قرار داد .

زمان و دمای گرمخانه گذاری بسته به نوع میکروارگانیسم مورد جستجو متفاوت بوده و ممکن است در دو مرحله انجام شود . - شمارش

 پس از پایان زمان گرمخانه گذاری پلیت‏ها و صافی‏ها را سریعأ مورد بررسی قرار دهید و در صورتی که امکان بررسی سریع آن نیست . می‏توان پلیت‏ها را در دمای 4 تا 5 درجه سلسیوس حداکثر به مدت 24 ساعت نگه داری نمود .

در مورد یک سری رقت متوالی پلیتی را شمارش کنید که بین 25 تا 300 پرگنه دارد .

برای محاسبه نتایج , از آنجا که هر پرگنه از یک میکروارگانیسم منشأ گرفته می‏توان نتایج را به عنوان تعداد واحد پرگنه ساز 10  در حجم معین نمونه محاسبه نمود .

- شمارش و غنی سازی بوسیله تلقیح در محیط کشت مایع

 روش براساس تلقیح حجم معینی از نمونه در محیط کشت مایع است تا از رشد میکروارگانیسم‏های خاص اطمینان یابیم . کاربرد روش فوق در موارد زیر است .

 10-1- آزمون برای وجود یا عدم وجود میکروارگانیسم‏ها - پس از تلقیح حجم معین در محیط کشت مایع و گرمخانه گذاری , با پیدایش تظاهرات ناشی از رشد میکروارگانیسم می‏توان به وجود یا عدم وجود آن در حجم معین نمونه پی برد .

 10-2- آزمون برای غنی سازی - در مواردی که تعداد احتمالی باکتری در نمونه کم است و شمارش نیز مطرح نیست می‏توان حجم معینی از نمونه را در محیط کشت مایع فاقد عوامل بازدارنده از رشد تلقیح نمائید . پس از گرمخانه گذاری آن را به محیط کشت انتخابی جامد منتقل کنید .

- آزمون برای شمارش - روش تخمین محتمل‏ترین تعداد .(N.P.M) 11

 روش براساس نظریه احتمالات بوده و فرض براین است که میکروارگانیسم‏ها با یک توزیع یکنواخت و به صورت انتخابی در نمونه پخش شده‏اند

. پس از تلقیح حجم‏های مختلف نمونه به لوله‏های حاوی محیط مایع و گرمخانه گذری , تغییرات ویژه ای ناشی از رشد باکتری‏ها مانند کدورت , تولید گاز , تغییر PH ظاهر خواهد شد

 . با در نظر گرفتن تعداد لوله‏های مثبت و با استفاده از جداول آماری می‏توان بیشترین تعداد احتمالی باکتری‏ها را تخمین زد .

- انتخاب روش

 انتخاب روش آزمون آب به عوامل متعددی از جمله ویژگی‏های فیزیکی - شیمیائی نمونه , و نوع میکروارگانیسم مورد جستجو دارد

. انتخاب روش در موارد مختلف به شرح زیر است .

 11-1- در مواردی که آب حاوی ذرات معلق است , استفاده از روش صافی غشائی مناسب نمی‏باشد . (به علت مسدود شدن صافی‏ها توسط ذرات معلق و حتی موجودات زنده مانند میکروپلانکتون‏ها) مسدود شدن روزنه صافی‏ها باعث کاهش عبور مواد غذائی از صافی شده و در نتیجه عدم تشکیل پرگنه می‏شود).

 11-2- در مورد آبهای خیلی کدر روش .N.P.M تنها روشی است که می‏توان استفاده نمود .

-4- در مواردی که مواد محلول در آب زیاد است استفاده از روش صافی غشائی توصیه می‏شود

11-5- در مواردی که احتمال وجود بیش از 100 پرگنه روی هر صافی وجود دارد استفاده از روش صافی غشائی از حساسیت لازم برخوردار نمی‏باشد .

 11-6- در مواردی که تعداد میکروارگانیسم‏ها در نمونه کم است ( کمتر از 100 عدد در هر میلی لیتر ) استفاده از روش کشت سطحی مناسب نمی‏باشد .

11-8- در مورد آب‏های حاوی ذرات معلق استفاده از روش کشت ((مخلوط کردن نمونه با محیط کشت)) (پورپلیت) به دلیل شمارش ذرات به جای پرگنه و ((روش کشت سطحی )) به دلیل نداشتن حساسیت لازم مناسب نمی‏باشد .

11-10- به طور کلی روش .N.P.M به دلیل تخمینی بودن نسبت به روش شمارش در محیط جامد دارای دقت کمتری می‏باشد . توصیه می‏شود در صورت امکان به طور هم زمان از هر دو روش استفاده نمود .

جستجو و شمارش کلیفرم ها در آب به روش چند لوله ای

1 ـ هدف

 هدف ارائه یک روش مرجع برای شناسائی و شمارش کلیفرم‏ها , کلیفرم‏های گرماپای و اشریشیاکلی فرضی در آب به وسیله کشت در محیط مایع به روش چند لوله‏ای و محاسبه بیشترین تعداد احتمالی 4 آنها در نمونه می‏باشد .

  2 ـ دامنه کاربرد

 این استاندارد در مورد کلیه آبها , حتی آبهایی که دارای ذرات و مواد معلق هستند , کاربرد دارد .

ـ تعاریف

3 ـ 1 ـ کلیفرم‏ها :

 منظور میکروارگانیسم‏هایی هستند که می‏توانند در شرایط هوازی در دمای35±0/5 و 37±0/5 درجه سلسیوس در محیط مایع لاکتوز رشد کرده و در مدت 48 ساعت تولید اسید و گاز کنند .

 3 ـ 2 ـ کلیفرم‏های گرماپای :

 منظور کلیفرم‏های تعریف شده در بند 3 ـ 1 هستند که قادرند در مدت 24 ساعت در دمای44±0/5 و44/5±0/25 درجه سلسیوس نیز تولید اسید و گاز کنند .

 3 ـ 3 ـ اشریشیاکلی فرضی :

 منظور کلیفرم‏های مقاوم به حرارت تعریف شده در بند 3 ـ 2 هستند که قادرند در مدت 24 ساعت در دمای 44±0/5و 44/5±0/25درجه سلسیوس از تریپتوفان تولید اندول و از لاکتوز و مانیتول تولید گاز کند .

ـ اساس روش

 4 ـ 1 ـ تلقیح نمونه یا رقتی از آن به یک سری لوله‏های حاوی محیط مایع انتخابی لاکتوز .

 4 ـ 2 ـ گرمخانه گذاری لوله‏ها در دمای 35 تا 37 درجه سلسیوس به مدت 24 تا 48 ساعت .

 4 ـ 3 ـ تجدید کشت هریک از لوله‏های دارای کدورت و گاز مثبت به محیط انتخابی تأییدی .

 4 ـ 4 ـ در مواردی که جستجوی اشریشیاکلی فرضی مورد نظر است , برای بررسی تولید اندول از لوله‏های فوق در یک محیط ترپتوفان دار کشت داده می‏شود .

 در مورد بررسی کلیفرم‏ها , محیطهای تأییدی در دمای 25 تا 37 درجه سلسیوس به مدت 48 ساعت قرار می‏گیرد و در مورد بررسی کلیفرم‏های گرماپای و اشریشیاکلی فرضی در دمای 42 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاری می‏شود . سپس با استفاده از جداول آماری بیشترین تعداد احتمالی کلیفرم‏ها , کلیفرم‏های گرماپای و اشریشیاکلی فرضی در 100 میلی‏لیتر از نمونه محاسبه می‏شود . (از تعداد لوله‏هایی که نتایج تأییدی مثبتی داشته‏اند).

ـ روش کار

 

7 ـ 1 ـ آماده سازی :

 آماده سازی و تهیه رقت‏های مورد نیاز را برطبق استاندارد ملی ایران به شماره 356 انجام

 7 ـ 2 ـ گرمخانه گذاری :

 لوله‏های تلقیح شده را برای مدت 48 ساعت در دمای 35±0/5 یا37±0/5 درجه سلسیوس قرار دهید .

 7 ـ 3 ـ بررسی :

 پس از مدت 18 تا 24 ساعت لوله‏ها را بررسی نمایید . لوله‏هایی که دارای کدورت همراه با تولید گاز و اسید (در مورد محیطهایی که دارای معرف PH هستند) هستند , به عنوان نتیجه مثبت در نظر بگیرید

 و لوله‏هایی را که منفی بوده و یک یا تمامی تغییرات فوق را نشان نداده است , مجددا تا 48 ساعت در گرمخانه قرار دهید .

ـ 4 ـ آزمون‏های تاییدی :

 از آنجا که واکنش مثبت در لوله‏های حاوی جدا ساز 5 تنها مربوط به کلیفرم‏های فرضی است , بنابراین انجام آزمون تأییدی بر روی محیط کشت انتخابی اهمیت داشته و ترجیحأ پرگنه‏های شاخص به مرحله آزمون تأییدی انتقال یابد

 . از هر یک از لوله‏های واکنش مثبت در یک یا چند لوله حاوی محیطهای تأییدی) کشت دهید تا تولید اندول و گاز مورد بررسی قرار گیرد .

 یادآوری 1: در صورتی که جهت جداسازی از محیط ساده آبگوشت لاکتوز استفاده می‏شود , توصیه می‏گردد

 از دو محیط انتخابی‏تر تأییدی آبگوشت لاکتوز  - صفرا - سبزدرخشان و اشریشیاکلی براث نیز استفاده شود .

ـ 4 ـ 1 ـ کلیفرم‏ها :

 برای تایید وجود کلیفرم‏ها , توسط حلقه کشت از لوله‏های واکنش مثبت برداشت نموده و به لوله حاوی محیط آبگوشت لاکتوز  - صفرا - سبزدرخشان تلقیح نمایید . لوله را در دمای 35 تا 37 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری نموده و پس از 48 ساعت از نظر تولید گاز بررسی کنید .

 7 ـ 4 ـ 2 ـ کلیفرم‏های گرماپای :

 توسط حلقه کشت از لوله‏های واکنش مثبت برداشت نموده و به لوله حاوی محیط آبگوشت اشریشیاکلی تلقیح نمایید . لوله را در دمای 44 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری نموده و پس از 24 ساعت از نظر تولید گاز بررسی نمائید .

 7 ـ 4 ـ 3 ـ اشریشیاکلی فرضی :

 توسط حلقه کشت از لوله‏های واکنش مثبت بند 7 ـ 3 برداشت نموده و به لوله حاوی محیط آب تریپتونه تلقیح نمایید . سپس لوله‏ها را به مدت 24 ساعت در دمای 44 درجه سلسیوس قرار دهید

 . پس از پایان این مدت مقدار 0/2 تا 0/3 از معرف کواکس به لوله‏ها اضافه نمایید . پس از تکان دادن لوله‏ها , ایجاد رنگ قرمز دلیل بر حضور اندول است .

ـ 5 ـ آزمون اکسیداز : برخی از میکروارگانیسم‏هایی که در آب یافت می‏شوند , ممکن است در بسیاری از جهات مشابه با کلیفرم‏ها باشند . این میکروارگانیسم‏ها فقط در دمای کمتر از 37 درجه سلسیوس قادر به تخمیر لاکتوز و تولید گاز هستند ولی از نظر آزمونهای تأییدی منفی هستند و حضور آنها در آب حائز اهمیت نمی‏باشد .

گونه‏های آئروموناس نیز که به طور طبیعی در آب وجود دارند , فقط در دمای 37 درجه سلسیوس یا کمتر از لاکتوز تولید اسید و گاز می‏کنند و موجب تداخل در روند آزمون می‏شوند . این میکروارگانیسم‏های اکسیداز مثبت بوده و قابل تشخیص از کلیفرم‏ها می‏باشند .

 7 ـ 5 ـ 1 ـ آزمون اکسیداز را با کشت خالص از باکتری تخمیرکننده لاکتوز که روی محیط آگار مغذی رشد کرده است , به صورت زیر انجام دهید .

 - 2 یا 3 قطره از معرف اکسیداز را روی یک کاغذ صافی در یک پیلیت قرار دهید .

 - با استفاده از یک میله شیشه‏ای , سواب یا سوزن کشت پلاتینی (نیکل و کروم نباشد) مقداری از پرگنه را روی کاغذ صافی قرار دهید .

 - ظهور رنگ ارغوانی مایل به آبی تیره در مدت 10 ثانیه را به عنوان واکنش مثبت درنظر بگیرید .

کیفیت آب- جستجو و شناسایی اشریشیا کلی و  کلی فرم ها

قسمت اول : روش صافی غشایی

هدف ، تعیین روش آزمون شناسایی و شمارش اشریشیاکلی و کلی فرم ها در آب بوسیلة صافی غشایی به دو روش((سریع)) و ((استاندارد)) می باشد .

2        دامنه کاربرد

این استاندارد در مورد تمامی انواع آب به غیر از موارد زیر کاربرد دارد :

2-1     آب هایی که حاوی مقادیر قابل توجه ذرات و مواد معلق باشند، به گونه ای که در عمل صاف سازی ایجاد اختلال کند .

2-1     آب هایی که دارای تعداد زیادی از میکروارگانیسم های دیگر باشند، به گونه ای که رشد آنها مانع از شمارش دقیق کلیفرم ها شده و یا وجود آنها با فرایند صاف سازی تداخل ایجاد کنند .

اصطلاحات و تعاریف

در این استاندارد اصطلاحات و / یا واژه ها با تعاریف زیر به کار می رود :

4-1     باکتری های لاکتوز مثبت

(روش استاندارد)

منظور، باکتری هایی هستند که در شرایط هوازی در دمای 3 ± 36 درجه سلسیوس بر روی محیط کشت انتخابی و افتراقی دارای لاکتوز رشد نموده، در مدت 3 ± 21 ساعت تولید اسید کنند

4-2     کلیفرم ها

(روش استاندارد)

منظور، باکتری های لاکتوز مثبت تعریف شده در بند 4-1 است که اکسیداز منفی می باشند .

4-3     اشریشیا کلی

(روش استاندارد)

منظور، باکتری های کلی فرم تعریف شده در بند 4-2 است که در دمای 5/0 ± 44 درجه سلسیوس به مدت 3 ± 21 ساعت از تریپتوفان تولید ایندول کنند .

          روش استاندارد

روش استاندارد براساس قرار دادن صافی غشایی بر روی محیط کشت انتخابی جامد لاکتوز دار و گرمخانه گذاری آن در دمای 3 ± 36 درجه سلسیوس بمدت 3 ± 21 ساعت می باشد .

کلنی های مشخص تشکیل شده در سطح صافی غشایی، بعنوان باکتری های لاکتوز مثبت شمارش می شود. پس از انتخاب کلنی های مشخص و تجدید کشت آن ها، آزمونهای تأییدی شامل تولید ایندول و همچنین آزمون اکسیداز انجام می گردد و سپس تعداد احتمالی باکتریهای کلی فرم و اشریشیاکلی در 100 میلی لیتر نمونه محاسبه می شود .

6        نمونه برداری

6-1     مقدار یک تا پنج لیتر آب را با رعایت شرایط زیر نمونه برداری کنید :

آب -  جستجو و شناسایی کلیفرم ها به روش وجود -

 عدم وجود - روش آزمون میکروبیولوژی

مقدمه

شناسایی باکتری های نشانگر یکی از بهترین راه ها برای ارزیابی کارائی روشهای تصفیة آب است . باکتر های کلیفرم به دلیل سرعت و سهولت جدا سازی و شناسایی ، شاخص میکروبی مناسبی  برای تعیین کیفیت آب آشامیدنی هستند این باکتریها نباید در آب آشامیدنی تصفیه شده وجود داشته باشند . وجود باکتریهای کلیفرم در آب نشانگر فرآیند ناکافی و یا آلودگی پس از تصفیه است .

1- Presence- Absence (P-A) Coliform test .

 

یکی از روش های ساده  برای شناسایی کلــیفرم ها در آب روش آزمون وجود - عدم وجود کلیفرم1 می باشد. این روش امکان آزمون تعداد زیادی از نمونه های آب را به طور همزمان فراهم می کند

4-1     کلیفرم ها

گروهی از باکتری های هوازی و بی هوازی اختیاری ، گرم منفی ، میله ای شکل و بدون اسپور هستند که قادرند در شرایط هوازی در محیط های کشت انتخابی لاکتوزدار در دمای 5/0 ± 35 درجه سلسیوس در مدت 24 تا  48 ساعت تولید اسید و گاز کنند .

          اساس روش

این روش  براساس تلقیح حجم معینی از نمونه آب به محیط انتخابی لاکتوز دار و گرمخانه گذاری در دمای 5/0 ± 35 درجه سلسیوس انجام می پذیرد . سپس با استفاده از محیط های کشت انتخابی و تائیدی ، وجود کلیفرم ها تائید می شود . 

6        نمونه برداری

دست کم 500 میلی لیتر آب را (طبق استاندارد ملی 4208) سال 1376 آئین کار نمونه برداری از آب جهت آزمونهای باکتریولوژی نمونه برداری کنید .

7-1-1 آبگوشت P-A 1


1- P-A broth

2طرز تهیه :

ترکیبات فوق را با جوشاندن در آب مقطر حل نمائید . سپس به حجم های 50 میلی لیتر در ظروف شیشه ای با گنجایش 250 میلی لیتری ریخته ، و در اتوکلاو با دمای 1 ± 121 درجه سلسیوس به مدت 12 دقیقه سترون کنید . pH  نهایی محیط باید 2/0± 8/6 باشد.

روش اجرای آزمون

9-1     تلقیح نمونه

نمونه مورد آزمــون را به مــدت 5 ثانــیه بشدت تکان دهید. سپس 100 میلی لیتر از آن را به 50 میلی لیتر محیط کشت آبگوشت P-A بند 7-1-1 با غلظت سه برابر تلقیح نموده و پس از یکنواخت شدن ، در دمای 5/0 ± 35 درجه سلسیوس به مدت 24 تا 48 ساعت گرمخانه گذاری نمائید  .

9-2     بررسی نمونه

نمونه تلقیح شده بند 9-1 را پس از پایان زمان گرمخانه گذاری بررسی کنید . مشاهده رنگ زرد در  محیط کشت آبگوشت P-A  نشانگر تخمیر لاکتوز و تولید اسید و گاز همچنین حباب گاز

است. که با تکان دادن ظرف به آرامی حباب گاز و کف را می توانید در سطح آن مشاهده کنید. تولید اسید و گاز نشانگر وجود احتمالی کلیفرم ها در نمونه مورد آزمون می باشد که برای تائید آن باید آزمون تائیدی انجام پذیرد .

9-3     آزمون تائیدی

برای تائید وجود کلیفرم ها ، با استفاده از حلقه کشت سترون ، از کشت بند 9-2 که تولید اسید و گاز نموده اند ، برداشت نموده و به محیط کشت آبگوشت لاکتوز - صفرا - سبز درخشان بند

7-1-2 انتــقال داده و در دمای 5/0± 35 درجه سلسیوس به مدت 24 تا 48 ساعت گرمخانه گذاری نمائید. مشاهده گاز و کف در محیط فوق ، نشانگر وجود باکتری های کلیفرم در نمونه مورد آزمون می باشد .

10      بیان نتایج

نتایج را بصورت "" کلیفرم ها در 100 میلی لیتر نمونه آب وجود دارد "" و یا "" کلیفرم ها در 100 میلی لیتر نمونه آب وجود ندارد "" بیان کنید .

روش شمارش بیشترین تعداد احتمالی اشریشیاکلی با استفاده از MUG   روش شمارش بیشترین تعداد احتمالی 1 اشریشیا کلی 2 با استفاده از  (MUG) 3

  1 - هدف

 هدف از تدوین استاندارد ارائه روش براش شمارش اشریشیا کلی با استفاده از MUG میباشد . کلی فرم‏های دیگر را نیز با این روش میتوان شمارش نمود .

- تعریف

 3-1- اشریشیاکلی : در این استاندارد , منظور از اشریشیا کلی باکتری گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه است که میتواند در دمای 30 درجه سلسیوس ترکیب MUG را شکسته و ترکیبی با خاصیت فلوئورسانس ایجاد نماید .

 این باکتری همچنین قادر به تولید اندول از تریپتوفان میباشد .

 3-2- کلی فرم‏ها : نام غیر رسمی برای تعدادی از باکتریهای گرم منفی که به خانواده انتروباکتریاسه تعلق دارند . در این استاندارد منظور از کلی فرم‏ها , کلیه باکتریهای گرم منفی بدون اسپوری هستند که در درمای 30 درجه سلسیوس تا مدت حداکثر 48 ساعت میتوانند لاکتوز را تخمیر , گاز تولید نموده و نیز پرگنه‏های مشخص بر روی محیط جامد بند (6-2) ایجاد کنند .

- اساس و روش

 ترکیب 4 - متیل آبلی فریل بتا - د -  گلوکورونید توسط آنزیم بتا - د - گلوکورونیداز 4 شکسته شده و ترکیب حاصل متیل آمبلی فرون ماده است که زیر لامپ ماورای بنفش با طول موج 366 نانومتر خاصیت فلوئورسانس از خود نشان میدهد .

 لامپهای ماورابنفش با طول موج کوتاه مناسب نمیباشند .

 94 درصد از سویه‏های اشریشیاکلی این خاصیت را از خود نشان می‏دهند .

 - آزمایش تولید اندول از تریپتوفان برای شناسایی اشریشیاکلی بر روی همان محیطی که حاوی MUG است انجام می‏گیرد .

 

روش آزمایش شمارش بشقابی

محیط کشت مورد نیاز نوترینت آگار می باشد. روش آزمایش به این ترتیب است که 1 میلی لیتر از نمونه مورد نظر را در پلیت استریل ریخته و 10 میلی لیتر از محیط کشت مورد نظر را به آن اضافه می کنیم و به صورت    8  پلیت را تکان می دهیم سپس محیط کشت را پس از جامد شدن به مدت 24 ساعت در انکوباسیون 35 درجه قرار می دهیم و پس از آن در صورت رشد کلنی ها آنها را روی کلنی کانتر قرار داده و شمارش کلنی ها را انجام می دهیم.

 

 

رنگ آمیزی گرم

معروفترین نوع رنگ آمیزی مرکب نوع گرم می باشد . این روش مفیدترین روش تشخیص باکتریها می باشد.

میکروبشناسی بنام کریتستیان گرم در سال 1884 بطور تصادفی واکنشی را کشف کرد که بعدها واکنش رنگ آمیزی گرم نامیده شد.

بر این اساس باکتریها با توجه با ساختمان دیواره یاخته ای (سلولی) به دو بخش بزرگ و کلی تقسیم می شوند: باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی . تفاوت عمده بین این دو گروه تفاوتهای ساختاری(ساختمانی) بین این دو گونه می باشد به این ترتیب که در گونه گرم مثبتها در دیواره سلولی نوعی پلی ساکارید بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی ضخیم تر می باشد در صورتیکه در دیواره سلولی نوع گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی نازکتر از نوع گرم منفی می باشد.

بر همین اساس در رنگ آمیزی گرم با توجه به این تفاوت مهم در دیواره سلولی ، از دو نوع رنگ استفاده می شود ، رنگ اولیه کریستال ویوله می باشد . هنگامیکه محلول کریستال ویوله به گسترش باکتریایی اضافه می شود این رنگ با ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی ترکیب شده و کمپلکس کریستال ویوله – ریبونوکلئات را بوجود می آورد و بعد از شستشوی رنگ اضافی ، محلول ید را بکار می برند . این محلول ید که ترکیبی فلزی می باشد به رنگ متصل شده و یک ترکیب رنگی غیر محلول ایجاد می کند بنام کمپلکس کریستال ویوله –ید که در سر دیگر آن متصل شده به ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی و تشکیل کریستال ویوله – ید – ریبونوکلئات داده است در حالیکه در باکتریهای گرم منفی چنین کمپلکسی ایجاد نمی شود. این پیوند در باکتریهای گرم مثبت بسیار پایدار است و در مرحله بعدی توسط ماده رنگ بر شکسته نمی شود و رنگ بنفش کریستال ویوله را در خود حفظ کرده بنابراین باکتریهای گرم مثبت زیر میکروسکوپ بنفش رنگ دیده می شوند.

از طرفی در دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته است بنابراین چربیها در الکل استن که در مرحله بعدی بعنوان رنگ بر بکار می روند ، محلول هستند و در اثر این واکنش چربیها از دیواره سلولی خارج شده و در اثر شستشو با حلال رنگ بر ، رنگ کریستال ویوله هم از سطح باکتری خارج می شود . با خروج چربی توسط ماده رنگ بر ، بر اندازه منافذ دیواره سلولی افزوده شده که این امر باعث بی رنگ شدن سریع باکتریهای گرم منفی می شود .در این مرحله باکتریهای گرم منفی از کریستال ویوله پاک می شوند . بنابراین بعد از شستشو توسط آب و افزوده شدن رنگ دوم یعنی سافرانین (فوشین) ، این رنگ به دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی جذب شده و باکتریها به رنگ قرمز در می آیند و در بررسی میکروسکوپی ، باکتریهای گرم منفی برنگ قرمز دیده می شوند.

اکثر باکتریهای موجود ، گرم منفی هستند البته بعضی از باکتریها ، مخمرها و تعدادی از کپکها گرم مثبت هستند.

بنابراین مراحل رنگ آمیزی گرم را می توان به شرح زیر بیان نمود:

1-        تهیه گسترش روی لام : ابتدا از نمونه باکتری  یک گسترش روی لام تهیه می کنید.

2-        رنگ آمیزی با کریستال ویوله : در این مرحله مقداری از رنگ کریستال ویوله را با قطره چکان به روی سطح گسترش میکروبی روی لام بریزید و بگذارید 1 دقیقه بماند تا رنگ در دیواره سلولی میکروبها نفوذ کند.

3-        مرحله شستشو: پس از سپری شدن مدت زمان 1 دقیقه ، رنگ اضافی روی لام را خالی کرده و با استفاده از آب مقطر سطح روی گسترش را شستشو دهید.

4-        مرحله اضافه کردن محلول ید : جند قطره از محلول ید را روی گسترش پخش نموده و بگذارید بمدت 1 دقیقه به همان حالت بماند . بعد محلول اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو دهید.

5-        مرحله رنگ بری با استفاده از استن – الکل : لام را با زاویه 45 درجه نگهدارید بعد با استفاده از محلول رنگ بر الکل – استن که بر روی گستره می ریزید بسرعت آنرا بی رنگ کنید. دقت کنید مرحله بی رنگ سازی بیش از اندازه نباشد. بعد از آن لام را بسرعت بشوئید . این عمل ، بی رنگ شده را متوقف خواهد کرد.

6-        رنگ آمیزی با سافرانین : در این مرحله سطح گسترش را با رنگ ثانویه یعنی سافرانین بپوشانید و 30 تا 60 ثانیه صبر کنید . بعد از آن رنگ اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو دهید.

7-        لام رنگ آمیزی شده را آهسته روی کاغذ خشک کن قرار دهید ولی کاغذ را روی گسترش نکشید.

نکات مهم :

1-        حرارت بیش از اندازه هنگام تثبیت گسترش باعث پاره شدن دیواره سلولی باکتری شده . بنابراین باکتری گرم مثبت رنگ اولیه (کریستال ویوله) را هنگام رنگ بری از دست می دهد و رنگ ثانویه را جذب می نماید و در نتیجه باکتری گرم مثبت ، بصورت گرم منفی دیده می شود.

2-        اگر گسترش ضخیم باشد هنگام مرحله بی رنگ شدن ، ممکن است مانند یم گسترش معمولی رنگ نشود و این مسئله باعث خطا در تشخیص شما در گرم منفی یا مثبت بودن باکتری خواهد شد.

3-        غلظت درست و تازه بودن رنگها هم در رنگ آمیزی موثر است .

4-        رنگ بری بیش از حد ممکن است باعت پاره شدن جدار باکتریهای گرم مثبت شده در نتیجه این باکتریها رنگ کریستال ویوله خود را از دست داده و رنگ ثانویه را جذب می نماید و بصورت گرم منفی دیده می شود.

5-        دقت شود هنگام تهیه گسترش روی لام از محیط کشت ، سن کشت باکتری باید 24 ساعت یا کمتر باشد . بنابراین در محیط کشتهایی که از عمر آنها گذشته و کهنه شده اند ، در قابلیت نفوذ دیواره سلولی باکتریها تغییراتی حاصل می شود که خاصیت گرم مثبت بودن را از دست می دهد.

در رنگ آمیزی گرم مثبت باکتریها را به 5 گروه تقسیم بندی می کنند:

1-        میله ای (باسیل ) گرم مثبت 2- میله ای گرم منفی 3- کوکوس (گرد) گرم مثبت 4- کوکوس گرم منفی 5- باکتریهای بدون واکنش به رنگ آمیزی گرم.

در این رنگ آمیزی می توان هر باکتری ناشناخته ای را در یکی از این 5 گروه قرار داده و با اطمینان 4 گروه دیگر را حذف کرد و به مطالعه در مورد آن باکتری پرداخت .

خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی :

1-        باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.

2-        گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود . پس هنگام تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت . یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم متبت ، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.

3-        باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .

4-        باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری و هضم و متلاشی شده آن می شوند.

طرز تهیه رنگها و محلولهای گرم :

1-        کریستال ویوله :

- کریستال ویوله                        2 گرم

- اتانول 95%                         20سی سی

- اگزالات آمونیوم(خالص)           8/.گرم

- آب مقطر                             80سی سی

کریستال ویوله را در اتانول حل کنید. اگزالات آمونیوم را در آب حل کنیدو سپس دو محلول را روی هم ریخته و بخوبی مخلوط کنید.

2-        محلول ید:

- ید                                       1 گرم

- یدور پتاسیم                           2 گرم

- آب مقطر                             300 سی سی

ید و یدور پتاسیم را با هم در هاون بسائید تا کاملا نرم شود . مقدار کمی آب اضافه کنید تا محتویات هاون شسته شود. بقیه آب را هم اضافه کرده و کاملا مخلوط کنید . این محلول را باید در شیشه تیره رنگ نگداری کنید.

3-        محلول سافرانین :

- سافرانین                              25 گرم

- اتانول 95%                         10سی سی

- آب مقطر                             100سی سی

سافرانین را در اتانول حل کنید . آب مقطر را اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را از کاغذ صافی عبور دهید.

4-        محلول استن – الکل :

- اتانول 95%                        70 سی سی

- استن                                  30سی سی

دو محلول را کاملا با هم مخلوط کنید.