سایت بهداشت محیط ایران
بهداشت محیط،آب وفاضلاب، مواد زائد ، بهداشت مواد غذایی،استخدامی بهداشت محیط
سایت بهداشت محیط ایران
بهداشت محیط،آب وفاضلاب، مواد زائد ، بهداشت مواد غذایی،استخدامی بهداشت محیطگزارش کار آزمایشگاه میکروبیولوژی
گزارش کار آزمایشگاه میکروبیولوژی
مقدمه
آب آشامیدنی آب گوارائی است که عوامل فیزیکی , شیمیائی و بیولوژیکی آن در حدی باشد که مصرف آن عارضه سوئی در کوتاه مدت و یا دراز مدت در انسان ایجاد نکند .
با توجه به اینکه در هنگام عبور آب در لولهها امکاناتی جهت آلودگی وجود دارد لذا دو نکته اساسی باید مورد توجه قرار گیرد .
الف : فشار آب درون شبکه لوله کشی باید در کلیه قسمتها بنحوی حفظ گردد که امکان انتقال , الودگی از خارج بدرون لولهها فراهم نگردد .
ب : میزان کلر باقیمانده باید در حدی باشد که آلودگیهای اتفاقی در شبکه را از بین ببرد
ویژگیهای بیولوژیکی و حدمجاز آلودگی باکتریولوژیکی آب آشامیدنی
ویژگیهای میکربی آب آشامیدنی مبنای قضاوت در مورد تعیین قابلیت شرب آبها از نقطه نظر بیولوژیکی قرار می‌گیرد . البته قضاوت صحیح بدون رعایت سایر جوانب از جمله شرایط و دوره تناوب نمونه برداری نگهداری نمونهها و بالاخره دقت در انجام آزمایشها میسر نخواهد بود .
اصولا آبی که بمصرف آشامیدن میرسد باید از میکرو اورگانیسمهای بیماریزای شناخته شده و همچنین باکتریهای نشانگر که نشانه آلودگی آب با مدفوع است عاری باشد . کلیفرمها مهمترین باکتریهای نشانگر هستند که در آزمایش باکتریولوژیکی آبها مورد توجه قرار میگیرند . گرچه این باکتریها غیر از مدفوع در منابع دیگر نظیر آب و خاک نیز ممکن است یافت شوند ولی فراوانی بسیارشان در مدفوع انسان و سایر حیوانات خونگرم و دارا بودن ویژگیهای دیگر است که باعث میشود این باکتریها در آزمایشهای مستمر آبهای آشامیدنی از اهمیت خاصی برخوردار باشند . باکتریهای کلیفرم را میتوان چنین تعریف نمود : " کلیه باکتریهای گرم منفی میلهای شکل بدون هاگ که میتوانند در حضور املاح صفراوی رشد کرده و در مدت 24 تا 48 ساعت در دمای 35 تا 37 درجه سانتیگراد از قند لاکتوز اسید , گاز والدئید تولید کرده و اکسید از منفی باشند ". آن دسته از کلیفرمها که میتوانند در دمای 44 درجه سانتی گراد تا مدت 48 ساعت از اسید آمینه تریپتوفان , اندول تولید نمایند بعنوان اشریشیاکلی شناخته میشوند که در صورت لزوم میتوان آزمایشهای تائیدی IMVIC را انجام داد .
باکتریهای نشانگر دیگر مانند استرپتوکوکوسهای مدفوعی و کلوستریدیومهای احیأ کننده سولفیت نیز میتوانند در تعیین منشأ آلودگی آب با مدفوع و ارزشیابی کارآیی روش کلرینه کردن مورد استفاده قرار گیرند .
- استانداردهای باکتریولوژیکی آب آشامیدنی
آب آشامیدنی باید از باکتریهای کلی فرم عاری باشد . هنگامیکه استانداردهای باکتریولوژیک توصیه می‌گردد باید توجه داشت که بین آب شبکههای بزرگ که توسط عده زیادی از مردم مصرف میشود و چاههای خانگی یا چشمهها و چاههائی که توسط عده کمی از مردم مورد استفاده قرار می‌گیرد تفاوت از نظر نحوه آبرسانی وجود دارد . بعنوان مثال : در مورد اجتماعات کوچک ممکن است لولهکشی از منبع آب از نظر اقتصادی عملی نباشد . باید در نظر داشت که آیا آب لولهکشی کلرینه شده است ؟ و نمونه‌برداری قبل و یا بعد از وارد شدن آب به شبکه توزیع صورت گرفته است . نحوه نمونه‌برداری جهت آزمایش باکتریولوژیک آب دارای اهمیت بسیاری است .
آزمایشگاه میکروبی:
ویژگیهای میکروبی آب آشامیدنی مبنای قضاوت در مورد تعیین قابلیت شرب آبها از نقطه نظر بیولوژیکی قرار می گیرد. البته قضاوت صحیح بدون رعایت سایر جوانب از جمله شرایط و دوره تناوب نمونه برداری، نگهداری نمونه ها و بالاخره دقت در انجام آزمایشها میسر نخواهد بود.
اصولا آبی که به مصرف آشامیدن می رسد باید از میکروارگانیسم های بیماریزای شناخته شده و همچنین باکتریهای نشانگر که نشانه آلودگی آب با مدفوع است عاری باشد. کلیفرمها بهترین باکتری های نشانگر هستند که در آزمایش باکتریولوژیکی آبها مورد توجه قرار می گیرند.
باکتریهای نشانگر دیگر مانند استرپتوکوکوس های مدفوعی و کلستریدیومهای احیا کننده سولفیت نیز می توانند در تعیین منشا آلودگی آب با مدفوع و ارزشیابی کارآیی روش کلرینه کردن مورد استفاده قرار گیرند.
شمارش کلی باکتریها: شمارش کلی باکتریها در آب دارای اهمیت زیادی نیست و بسیاری از آبهایی که کاملا سالم هستند ممکن است دارای تعداد زیادی باکتری باشند. بندرت دیده شده که آبی بدون باکتری باشد، ولی ممکن است آب چاههای بسیار عمیق تعداد نسبتا کمتری باکتری داشته باشند.
بطور کلی آب چاههای عمیق در مقایسه با آب چاههای کم عمق از کیفیت بهتری برخوردار هستند.
آزمایشهای آب
مشخص کردن اینکه آب آشامیدنی، دارای چه وضعی باشد کار ساده ای نیست، از آنجا که آبی که در اختیار ما قرار می‌گیرد محصولی ساختگی نمی‌باشد، نمی‌توان اختصاصات ثابتی را برای آشامیدن در نظر گرفت.
آزمایشهای میکروبی آب، کیفیت آب را جهت آشامیدن و سایر استفاده ها مشخص می‌سازد. این آزمایشات، درجه آلودگی آب به فضولات انسانی و حیوانی را مشخص می‌سازد. امروزه روشهای پیشرفته ای وجود دارد که امکان تعیین باکتریهای بیماری زا را در آب فراهم ساخته است ولی از آنجایی که جدا کردن آنها از نمونه های آب مشروب به صورت کار روزمره عملی دشوار است جستجو و شمارش میکروبهای اندیکاتور به عوض میکروبهای بیماری زا انجام می‌گیرد.
روشهای آزمایش
سه روش عمده که برای تعیین باکتریهای اندیکاتور در آب وجود دارد به قرار زیر میباشد:
الف) روش تخمیر چند لوله ای
ب) روش صافی غشایی
ج) روش شمارش بشقابی
ویژگیهای میکروبهای نشانگر عبارت است از
الف) سهولت شناخت و شمارش نشانگر
ب) وفور آن در طبیعت و حضور در روده حیوانات خونگرم
ج) مقاومت در مقابل عوامل محیطی
آب آشامیدنی از طریق تعیین کیفیت فیزیکوشیمیایی ومیکروب شناختی ارزیابی وانتخاب می‌گردد.
ویژگیهای آب سالم
1 ـ عاری از عوامل زنده بیماری‌زا باشد
2 ـ عاری از مواد شیمیایی زیان آور باشد
3 ـ بدون رنگ و بو، و طعم مطبوع داشته باشد
4 ـ قابل استفاده برای مصارف خانگی باشد آبی که یک یا دو مورد از ویژگیهای فوق را نداشته باشد (بویژه مورد یک و دو) آن را آلوده و برای شرب غیرقابل مصرف می‌دانند.
آلودگی آب : آب خالص مطابق ساختمان شیمیایی
آن به هیچ وجه در طبیعت وجود ندارد، لیکن انواع ناخالصی‌ها به صورت حل شده،
معلق یا بینابینی با خود دارد. که در بخش ناخالصی‌های آب آمده است. جنبه
وخیم تر، آلودگی آب ناشی از فعالیتهای انسانی است مانند شهرنشینی و صنعتی
شدن. تعریف آب آلوده آبی که دارای عوامل بیماریزای عفونی یا انگلی، مواد
شیمیایی سمی، ضایعات و فاضلاب خانگی و صنعتی باشد را آب آلوده گویند.
آلودگی آب از فعالیتهای انسانی، نشات می‌گیرد.
تقسیم بندی آبهای آشامیدنی
آبهای لولهکشی شده
آبهای تصفیه شده (نمونه برداری در هنگام ورود به شبکه توزیع )
آبهای تصفیه نشده ( نمونه‌برداری در هنگام ورود به شبکه توزیع )
در اولین نمونه برداری آب یا در یک نمونه اتفاقی وجود تا سه باکتری کلیفرم در 110 میلیلیتر میتواند مورد قبول قرار گیرد در صورتیکه اشریشیا کلی نباشد و مشروط بران که در نمونهبرداریهای بعدی تعداد کلیفرمها کمتر از 3 باشد . چنانچه سه باکتری کلیفرم ثابت ماند و یا افزایش یافت نشانه آن است که این نوع آب جهت آشامیدن مناسب نمی‌باشد .
آبهای تصفیه شده ( نمونه‌برداری از داخل شبکه توزیع )
آبهای لولهکشی نشده
از منابع آبی لولهکشی نشده ( چشمه , قنات , چاه ) با اعمال روشهای بهسازی مثل دور کردن منابع آلودگی از منبع آب و پوشانیدن سطح چاه حتی در مورد چاههای کم عمق, در اولین نمونه‌برداری یا در یک نمونه اتفاقی وجود تا 10 باکتری کلیفرم در 100 میلیلیتر آب مشروط بر آنکه اشریشیا کلی نباشد و در نمونهبرداریهای بعدی کمتر از 10 باکتری کلیفرم باشد قابل قبول است .
استاندارد روش نمونهگیری آب
این استاندارد دربر دارنده روشهای نمونهگیری آب برای تجزیه شیمیائی , فیزیکی میکروبیولوژیکی و رادیولوژیکی به ترتیب زیر میباشد :
روش (( الف )) ـ نمونهگیری لحظهای ( ناپیوسته )
روش (( ب )) ـ نمونهگیری مرکب
روش (( ج )) ـ نمونهگیری مدارم ( پیوسته )
در این استاندارد اصول مشخص برای یکنواخت کردن روشهای نمونهگیری تعیین شده است و این دستو کار در مقیاس عمومی قابل اجراء بوده و احتمالا در موارد خاص نیز کاربرد خواهد داشت .
واژه نمونهگیری که در این استاندارد به کار رفته به قرار زیر میباشد :
نمونهگیری عبارت است از به دست آوردن قسمتی از ماده که نمایانگر کل ماده مورد نظر باشد
این استاندارد شامل سه دستور کار برای جمع‌آوری نمونه است :
روش (( الف )) برای جمع‌آوری نمونه لحظهای از یک محل به خصوص میباشد که فقط معرف خصوصیات آب در زمان نمونهگیری است و این روش برای آزمونهای باکتریولوژی و برخی آزمونهای رادیولوژی مناسب میباشد .
روش (( ب )) برای جمع آوری نونه مرکب از یک محل به خصوص میباشد که قسمتهای نمونه در فواصل زمانی مختلف گردآوری میشود .
نمونه مرکب میتواند از جمع آوری مقادیر آب از مکانهای مختلف یک منبع و یا مجموعهای از آب گردآوری شده از محلهای مختلف در زمانهای مختلف تشکیل گردد .
در روش (( ج )) یک نمونهگیری , مداوم ( پیوسته ) از یک و یا چند ایستگاه نمونهگیری ایجاد می‌گردد که برای دستگاههای تجزیه مداوم آب مناسب میباشد .
نکات مهم
هدف از نمونهگیری به دست آوردن قسمت کوچکی از آب است که نمایانگر خصوصیات واقعی منبع اصلی باشد و مهمترین عوامل اساسی که برای رسیدن به این مقصود لازم است عبارتند از :
نقاط نمونهگیری , زمان نمونهگیری , تناوب نمونهگیری , و حفظ ترکیب نمونه تا زمان اجرای آزمایش .
در اغلب موارد به علت عدم یکنواختی در منبع آب , لزوم نمونهگیری از چند نقطه ایجاب میشود و در صورتیکه استفاده از محلی به عنوان نمایانگر بیشترین خصوصیات آب مقدور نباشد میتوان با شناخت و پی بردن به روابط فی مابین یا بهرهگیری از نتایج به دست آمده به کمک حداقل نقاط نمونهگیری این کار را عملی کرد .
یک نمونه نمایانگر واقعی را الزامأ از یک محل انتخاب شده نمی‌توان برداشت , بلکه تغییر کافی بر روی نتایج یک نمونه غیر معرف نیز میتوان اطلاعات با ارزشی در مورد روند تغییرات به دست داده و نمونهگیر را در جهت انتخاب محلهائی که اطلاعات حاصله بیشتر با حقیقت نزدیک باشد , راهنمائی و هدایت نماید .
باید توجه داشت اغلب نمونه هایی که از یک نقطه مجرد یک سیستم گردآوری میشود تا حدودی نمی‌توان به عنوان نمودار واقعی تلقی کرد , بنابراین موضوع قابل اهمیت این است که حدود معرف بودن نمونه را تشخیص داده و از نتایج به دست آمده آن برای ثبت مداوم کیفیت آب منبع استفاده نمود.
در غیر این صورت در هنگام تشکیل پرونده لازم است یک ضریب تصحیح فرضی یا ضریب دقت مناسب برای نمونهگیری تعیین و در نظر گرفته شود .
در هر روش نمونهگیری قواعد عمومی زیر باید به کار رود .
نمونهها باید نشاندهنده وضعیت موجود در نقطهای باشد که از آن محل عمل برداشت انجام گرفته است.
نمونهها باید دارای حجم مناسب به نحوی باشد که امکان تجدید پذیری آزمون به تعداد مورد نظر در روش آزمون مربوطه فراهم گردد .
نمونهها باید طبق روش جمع‌آوری , بستهبندی و حملونقل گردد که مراقبتهای لازم برای تأمین عدم تغییر در ترکیبات و خصوصیات ویژه نمونه تا مرحله تجزیه در آزمایشگاه در مورد آن اعمال شده باشد .
روشهای نمونهگیری
روش (( الف )) ـ نمونهگیری لحظهای
دامنه کاربرد :
الف ـ کاربرد این روش در مورد نمونهگیری از آب منابعی مانند (( چاهها , رودخانهها چشمهها و نهرهای کوچک , دریاچهها , اقیانوسها , مخازن , خطوط شبکه آبرسانی و مجاری آب , ظروف و مخازن تهیه و تولید , مولدهای بخار , برجها و صافیهای تحت فشار زیاد و یا زیر فشار جو )) برای آزمونهای شیمیائی , فیزیکی , باکتریولوژیکی و یا دادیولوژیکی میباشد .
ب ـ یک نمونه لحظهای تنها نمایانگر شرایط و وضعیت موجود در محل وزمان نمونه‌برداری است .
تناوب و مدت نمونهگیری :
الف ـ به منظور برآورد صحیح و منطقی از ترکیب آب خام جاری در یک شبکه لولهکشی3 شده از یک منبع بزرگ آب ( مانند دریاچه ) در نقطهای که به قدر کافی از ساحل دریاچه دور میباشد . برای پیشگیری از تغییرات درون لولهای و یا تغییراتی که به دلیل نفوذ فاضلاب به داخل شبکههای فرعی آب ممکن است ایجاد شود و بالاخره به منظور کسب طلاع از تغییرات فصلی در کیفیت آب , نمونهگیری انفرادی بازمان تناوب طولانی مانند هر دو هفته و یا ماهیانه کافی میباشد .
در صورتیکه نمونهها از نزدیک خط ساحلی چنین منبع آبی و یا رودخانه برداشته شود , باید دارای زمان تناوب کوتاهتر مثلا هر روزه باشد تا بتوان اطلاع دقیقتری از تغییرات حاصل در ترکیب آب را که در وصرف آن بسیار مهم است به دست آورد .
تنظیم درجه حرارت :
الف ـ هنگامیکه نمونه‌های در درجه حرارت بالاتر از دمای محیط برداشته میشود با استفاده از مارپیچ سرد کننده درجه حرارت آن را به درجه حرارت محیط برسانید .
ب ـ در بعضی از روشهای آزمون نیاز به تنظیم درجه حرارت دیگری غیر از درجه حرارت محیطی است , چنین تنظیمی را باید در صورت مشخص بودن آن انجام داد .
ذرات معلق :
الف ـ نمونهها معمولابدون جدا کردن ذرات معلق برداشته میشود و در صورتیکه آب موجود در منبع اصلی دارای موادی به صورت کلوئید و یا مواد معلق به هم پیوسته باشد نمونه را باید طوری برداشت که به طور نسبی نمایانگر این مواد نیز باشد .
حجم نمونه :
الف ـ حجمی حداقل برابر دو لیتر نمونه بردارید ولی برداشتن چهار لیتر نمونه از ارجعیت دارد .
ب ـ جدول شماره یک بیانکننده مقادیر تخمینی حجم نمونه مناسب برای اندازهگیری معمولی و اختصاصی ماده مورد نظر جهت انجام بار آزمون میباشد .
حجم نمونه مورد نیاز برای تجزیه باکتریولوژیکی آب بستگی زیادی با تراکم باکتریها در آب دارد و در مورد نمونه هائی که تراکم باکتری در آن زیاد است , رقیق کردن متوالی نمونه الزامی میباشد .
محل نمونهگیری
الف ـ منابع روباز :
1 ـ با نهایت دقت محلی را برای نمونهگیری انتخاب کنید که نمونه به دست آمده برای آزمون معرف واقعی توده آب باشد .
این نمونه نباید از کفهای سطحی آب برداشته شود .
2 ـ به دلیل وجود تغییرات وسیع در وضعیت نهرها , دریاچهها , مخازن و سایر تودههای آب , تشریح محل دقیق برای نمونهگیری امکان ندارد و هنگامیکه آب , یک نهر طوری مخلوط شود که به صورت تقریبأ یکنواخت درآید نمونهای که از هر نقطه از مقطع عرضی آب برداشته شود مناسب بوده ولی در مورد نهرها و رودخانههای بزرگ که احتمال مخلوط شدن آب وجود ندارد به تعداد نمونه بیشتری اجتیاج است و معمولا این نمونهها در عرض و عمق مختلف یک سطح مقطع رودخانه در هر محلی برداشته میشود .
3 ـ با در نظر گرفتن اطلاعات مورد نیاز و تطبیق شرایط محلی , نقطهای را برای نمونهگیری انتخاب کنید که در پائینتر از انشعاب رودخانه و یا محل دخول آلودگی با فاصلهای قرار داشته باشد که اختلاط کامل صورت گیرد و چنانچه این عمل مقدور نباشد , بهتر است نمونهگیری از بالای انشعاب رود و یا سرچشمه آلودگی و همچنین از محل انشعاب رود و یا سرچشمه آلودگی صورت پذیرد .
به طور کلی فاصلهای در حدود 1/5 تا 4/5 کیلومتر پائینتر از محل انشعاب و یا آلودگی کافی است .
4 ـ نمونهها را باید در فاصله حداقل دو کیلومتر دورتر از زیر سد و یا آبشار جمع آوری کرد تا هوای وارد شده در آب زمان کافی برای خروج را داشته باشد . در هنگام نمونهگیری از مخازن , دریاچه و یا سایر منابع مشابه , لازم است از نمونهگیری از ناحیههائی که معرف منبع اصلی نمی‌باشد مانند مناطق ورودی جریانهای کوچک آب , مناطق راکد آب و یا مناطق ساحلی که دارای تغییرات شدید است خود داری کرد مگر در صورتی که تعیین اثر وضعیت و شرایط محلی چنین نقاط , جزئی از برنامه نمونهگیری باشد .
5 ـ مطلوبتر است از هر منیع آب تعدادی نمونه برداشته شود تا تغییرات احتمالی در ترکیبات آب قبل از نقطه نهائی نمونهگیری تعیین گردد .
ب ـ جریانهای سرپوشیده
1 ـ انتخاب نقاط نمونهگیری در شبکههای لولهکشی , مجاری , مخازن , صافیهای تحت فشار و دستگاههای سبککننده شیمیائی آب , دستگاههای تهیه آب عاری از مواد معدنی , کندانسورهای سطحی , تبخیرکنندهها و یا لوله‌های کندانسور بستگی به رعایت چگونگی لولهکشی , موقعیت قرار گرفتن هر یک از واحدها و شکل آن , خصوصیت و تغییراتی که مابین ورود و خروج آب رخ میدهد و سرعت عبور جریان آب از واحد داشته و باید دقت کرد نمونه معرف هنگامی به دست میآید که عمل مخلوط کردن در محل به خوبی انجام پذیرفته باشد .
2 ـ در یک شبکه لولهکشی با باز کردن شیر و یا یکی از اتصالات که به فوریت آب را در دسترس قرار داده و جریان شدید ایجاد میشود را میتوان به عنوان یک محل نمونه‌برداری مناسب تلقی کرد .
در صورتی که شدت جریان آب کافی نباشد باید لوله نمونهگیری را مسافتی در داخل لوله آب فرو برد تا شدت جریان افزوده شود ( در حدود 25 درصد قطر لوله حداکثر تا 100 میلیمتر )
ظروف حامل نمونه :
الف ـ برای مشخصات ظروف حامل نمونه و چگونگی نگاهداری آن برای تجزیه شیمیائی , فیزیکی و رادیولوژیکی به استاندارد روش روزمره نمونهگیری آب مراجعه کنید .
ب ـ برای نمونه‌های مورد مصرف در آزمونهای باکتریولوژیکی چهار بطری دهانگشاد با در سمبادهای به ظرفیت حداقل 300 میلیلیتر آماده کنید .
این بطریها ممکن است از شیشه بور و سیلیکات و یا سایر مواد مقاوم در برابر حلالیت آب باشد و از درپوش فلزی و یا پلاستیکی پیچی نیز میتوان استفاده کرد .
بطریها , درپوشها و آستر درپوشها باید قادر به تحمل درجه حرارت استریلیزاسیون بوده و هیچگونه ترکیب فراری در هنگام عمل استیلیزاسیون از خود تولید نکرده و یا مواد سمی و یا ترکیبات متوقف کننده رشد باکتری نیز وارد نمونه آب نکند .
1 ـ بطری نمونهگیری را ابتدا با مواد تمیز کننده شسته و سپس با محلول داغ سولفوکرومیک تمیز نمائید و آثار محلول تمیز کننده در ظرف را توسط آب مقطر دوبار تقطیر شده آبکشی و سپس برای برطرف کردن اثر فلزات سنگین احتمالی موجود در باقیمانده کرومات با محلول رقیق اسید نیتریک شستشور دهید .
در خاتمه بطریها را با آب مقطر دوبار تقطیر شده آبکشی کرده و بگذارید خشک شود .
2 ـ در صورتیکه آب آب در نمونه برداشته شده حاوی باقیمانده کلر باشد , مقداری تیوسولفات سدیم تا ایجاد غلظت تقریبی 100 میلیگرم در لیتر به هر نمونه اضافه کنید . ولی در حالتی که تیو سولفات با مواد مصرفی بعدی احتمالا ایجاد اختلال و مزاحمت کند میتوان این مرحله را حذف کرد .
3 ـ در بطری را بسته و سر و کردن بطری را با ورق فلزی ( آلومینیومی ) برای جلوگیری از آلوده شدن بپوشانید و در هوای داغ خشک با دمای حداقل 170 درجه سانتیگراد و یا اتووکلاو با دمای حداقل 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استرلیزه کنید .
در طی این مدت باید در پوش بطری را برای جلوگیری از ترکیدن احتمالی آن کمی شل کرد و سپس یک نوار از ورق آلومینیم بین در شسشهای و جداره دهانه بطری قرار دهید .
جمع‌آوری نمونه
ـ نمونه برای آزمون میکروبیولوژی
1 ـ هنگامیکه برداشت نمونه از طریق شیر و یا لوله نمونهگیری انجام میشود لازم است آب حداقل به مدت پنج دقیقه و یا بیشتر برای شستشوی کامل سیستمی که به مدت دو ساعت و یا بیشتر راکد بوده است به میزان شش تا ده برابر حجم آن جریان یابد .
2 ـ خروجی نمونه را بسته و بدون لمس کردن قسمت درونی آن را خالی کنید . سپس با شعله مناسب و یا هر وسیله دیگری که دوده وارد لوله نکند محل خروجی نمونه را شعله بگیرید و در صورتی میتوان روش استفاده از شعله را حذف نمود که خروجی نمونه با استفاده از پنبه و پارچه اشباع شده با الکل اتیلیک تقلیب شده (70 درصد ) پاک شود .
3 ـ در صورتی که آب مورد نمونهگیری کلرینه شده و دارای باقیمانده کلر باشد و یا عامل اکسید کننده دیگری به صورت آزاد و یا ترکیبی باشد که به عنوان گندزدائی آب به کار رفته است , یک بطری نمونه‌برداری محتوی مقداری تیوسولفات سدیم انتخاب کنید , در غیر این صورت استفاده از تیوسولفات سدیم حذف می‌گردد .
در حالتی که افزودن تیوسولفات در آزمونهای بعدی مانند بررسی باکتریهای احیأ کننده سولفات و غیره ایجاد مزاحمت میکند باید از به کار بردن تیوسولفات در بطری نمونهگیری هر چند که عوامل گندزدا در آب نیر موجود باشد خودداری کرد و باید آزمون را به سرعت انجام داد .
4 ـ در بطری را بردارید , ترتیب برداشتن آن بدین صورت است که برای جلوگیری از آلوده شدن آن در اثر تماس مستقیم با دست , آن را با پوششی مانند کاغذ آلومینیم بردارید و برای اجتناب از لمس کردن دهانه بطری پائین بطری را گرفته و بدون آبکشی با آب مورد نمونهگیری آن را به سرعت در زیر جریان آب قرار داده و سهچهارم بطری را پر کنید تا عمل مخلوط کردن نمونه قبل از آزمون به سهولت قابل انجام باشد .
بدون تأمل در بطری را گذارده و ورق فلزی گردگیر را دور گردن بطری بپیچید و دقت کنید از تماس با در گردن بطری در حین عمل خودداری و حتیالامکان هیچگونه غباری در اثر وزش دخل بطری نشود .
5 ـ هنگامیکه آب مورد نمونهگیری بالاتر و یا پایین تر از فشار جو باشد باید از وسایل مخصوص برای برداشتن نمونه استفاده شود که در صورت اجازه دادن شرایط فیزیکی , سادهترین وسایل , استفاده از فشار سنج میباشد .
وسیله برداشت نمونه از یک خط لوله و یا سیستمی که تحت خلاء قرار دارد عبارت است از یک پمپ پیستونی کوچک که نمونه را به یک ظرف نمونهگیری که در فشار جو است منتقل میکند و این پمپ باید از مواردی بوده و ساختمان آن طوری باشد که باعث آلودگی نمونه نشود و ظرف (( گیرنده نمونه )) بین پمپ و نقطه نمونهگیری جای گیرد . با چنین ترتیبی نمونه موجود در ظرف گیرنده نمونه پس از بستن شیر آن و رسانیدن به فشار جو , به داخل ظرف نمونهگیری خالی خواهد شد .
نگاهداری نمونهها نمونه‌های آزمون باکتریولوژی در صورتیکه ظرف یکساعت پس از جمع‌آوری مورد آزمایش قرار نگیرد , احتیاج به سردکردن دارد .
1 ـ نمونههائی که در یک ساعت اول پس از جمع‌آوری مورد آزمون قرار می‌گیرد را میتوان بدون یخ زدن در محل سرد نگاه داشت .
2 ـ نمونههائی که بیشتر از یک ساعت از نمونهگیری امکان آزمایش آن فراهم میشود باید در یخچال و یا یخدان در درجه حرارتی که بیشتر از چهار درجه سانتیگراد نباشد نگاهداری نمود .
در هیچ حالتی فاصله زمانی بین جمع‌آوری و آزمون نباید بیشتر از 12 ساعت در موارد عادی و یا شش ساعت در مورد نمونه‌های مشکوک به داشتن مقادیر زیاد از ارگانیزم باشد .
برای دستور کارهای بررسی نمونه در محل ( آزمایشات صحرائی ) باید مدت زمان طولانیتری در نظر گرفته شود .
3 ـ در صورت حملونقل نمونهها را باید در ظرفی با جدار عایق که محتوی یخ است منتقل کرد تا دمای آن بین صفر تا چهار درجه سانتیگراد باقیمانده و امکان استفاده برای آزمون , ظرف 12 ساعت پس از جمع‌آوری فراهم گردد .
4 ـ اگر شرایط حفظ و نگهداری نمونه با بندهای 2 و 3 این قسمت تطبیق نکند شرایط واقعی را در گزارش آزمون بیان کنید .
برچسبگذاری و انتقال نمونه
الف ـ اطلاعات مشروحه زیر را بر روی قسمتی از شیشه که قبلا جهت نوشتن سمباده زده و مات شده است و یا بر روی یک برچسب چسبدار و یا برچسب پارچهای و یا کاغذی متصل به ظروف بنویسید :
* ـ شماره نمونه
* ـ تاریخ و زمان نمونهگیری
* ـ منبع نمونه
* ـ نقطه نمونهگیری ( با جزئیات کامل , بهطوریکه فرد دیگری به کمک آن از همان نقطه که نمونه برداشته شده است بتواند نمونه دومی را بردارد .)
* ـ درجه حرارت و سرعت جریان سیال در وسیله نمونهگیری
* ـ درجه حرارت نمونه
* ـ نوع و مقدار مواد محافظ افزوده شده
* ـ نتایج آزمونهای انجام شده در محل نمونهگیری ( آزمونهای صحرائی )
* ـ امضای نمونهگیر
ب ـ در ظروف نمونه را در محل خود محکم کرده و برای جلوگیری از تراوش نمونه در حین حملونقل آن را با سیم , نوار و یا ریسمان ببندید .
ظروف نمونه باید به اندازهای باشد که پس از پر کردن آن با حجم مورد نظر از نمونه حجمی معادل یک درصد از ظرفیت آن جهت انبساط مایع خالی باشد
ج ـ حملونقل ظروف نمونه باید در جعبه ( ترجیحأ چوبی ) انجام شود که این جعبه دارای محفظههای جداگانه برای هر یک از ظروف نمونه بوده و بقیه فضای آن در اطراف ظرف نمونه با کاغذ مچاله شده , نمد و یا مواد مشابه دیگری پر شده و یا ظرف نمونه در محل خود به وسیله گیرههای فنری , خاک اره و یا فوم پلاستیکی و یا موادی مشابه آن مستقر شود .
نمونههایی که به سرعت منجمد شده است باید برای باقی ماندن به حالت یخ زده همراه با انیدریک کربنیک جامد ( یخ خشک ) حملو نقل شود .
هـ ـ نشانی فرستنده و گیرنده را بهطور واضح در دو ظرف جعبه نوشته و یا توسط کارت و یا برچسب به آن متصل کنید و در صورت لزوم برچسبهای تشریحی و اخطاری مانند :
(( شکستنی ,)) (( مایع ,)) (( شیشه ,)) (( بادقت حمل شود ,)) (( این قسمت رو به بالا ,)) و در هوای سرد عبارت (( از یخ زدن جلوگیری شود ,)) را نیز به استثنأ نمونههایی که عمدا به صورت منجمد در میآید بر روی آن بچسبانید .
نمونه گیری مرکب
دامنه کاربرد
الف ـ روش نمونهگیری مرکب از آب در مورد تجزیههای دنبالهای فیزیکی و شیمیائی به کار رفته اما برای جمع‌آوری نمونه جهت آزمونهای دادیولوژیکی به خصوص رادیو نوکلئوئیدهای عمر کوتاه مناسب نمی‌باشد . ولی میتوان برای روشهای آزمون انفرادی به منظور تعیین تاثیر زمان تناوب قبل از تجزیه به آن مراجعه کرد .
ب ـ نمونه‌های مرکب برای آزمونهای باکتریولوژیکی و یا ترکیباتی که در زیرنویس ( ج ) از جدول شماره یک بیان شده است مناسب نمی‌باشد .
نمونهگیری پیوسته
دامنه کاربرد
با یکدیگر مخلوط کنید .
دفعات نمونه برداری بمنظور آزمایش باکتریولوژکی
دفعات نمونه برداری و آزمایش نمونه های آب باید کنترل صحیح کیفیت آب را امکان پذیر سازد.
« جدول نمونه برداری منابع آب کلرینه شده»
تعداد افراد مصرف کننده
حداقل تعداد نمونه های آزمایش شده در هر ماه
تا صد هزار نفر
یک نمونه بازای هر پنج هزار نفر
مازاد بر هر صد هزار نفر
یک نمونه بازای هر ده هزار نفر
تجهیزات آزمایشگاه میکروبیولوژی
* دستگاه انکوباکتور
* دستگاه اتوکلاو
* دستگاه بن ماری
* دستگاه سانتریوفوژ
* دستگاه کلنی کانت
* دستگاه فور
* یخچال آزمایشگاهی
* انواع میکروسکوپها
* دستگاه رنگ آمیزی باکتریها
* انواع محیط های کشت
* انواع ظروف شیشه ای آزمایشگاهی
انواع ظروف یکبار مصرف آزمایشگاهی
اتوکلاو:
وسیله است که توسط آن کلیه وسائل آزمایشگاهی و محیطهای کشت قبل از استفاده و محیطهای کشت میکروبی و غیره توسط حرارت مرطوب ، استریل می شوند . این دستگاه قادر است بخار آب اشباع شده را با حرارت 121 درجه سانتیگراد ایجاد نماید که این درجه حرارت در شرایط بخار ایجاد شده می تواند موجب تخریب ساختمان میکروبها و هاگ آنها شده و تقریبا باعث نابودی تمام میکروارگانیسمهای شناخته شده می شود.
اتوکلاوهای آزمایشگاه میکروبیولوژی اغلب روی فشار 15 پوند تنظیم شده اند که در این فشار بخار آب دمای آن به 121درجه سانتیگراد می رسد.این دستگاه طوری تنظیم شده است که بعد از رسیدن به این فشار بخار و درجه حرارت بلافاصله وارد مرحله سترون کردن می شود و مدت 15 دقیقه به همان حالت باقی می ماند. قبل از شروع مرحله سترون کردن ابتدا مدتی شیر خروج هوا را باز می کنیم تا هوای داخل دستگاه تخلیه شده و بخار آب تمام سطوح و منافذ را بپوشاند و عمل استریلیزلاسیون کامل انجام گیرد.
بعد از اتمام کار، دستگاه را خاموش کرده و توسط شیر خروجی بخار آب را خارج کرده و بعد درب دستگاه را باز می کنیم . ضمنا دستگاه دارای یک شیر اطمینان می باشد که بصورت خودکار بخار اضافی موجود در دستگاه را در حین انجام کار به بیرون هدایت می کند تا شرایط ثابت بماند.
اتو یا انکوباتور(گرمخانه):
دستگاهی است که توسط آن گرمای لازم جهت رشد باکتریها بعد از مرحله کشت ، فراهم می شود.
محیطهای کشت (مایع و جامد) را بعد از کشت دادن در درون این دستگاه قرار داده و درجه حرارت مورد نیاز باکتری را توسط دستگاه تنظیم می کنیم و بعد تا مدت معین محیطهای کشت در آن باقی می مانند. دمای درون اطاقک انکوباتور توسط یک دماسنج کنترل می شود.
فور الکتریکی : دستگاهی است که توسط آن یکسری از وسائل آزمایشگاه را با حرارت خشک استریل می کنند. این وسایل باید حتما فلزی یا شیشه ای باشند که مقاوم به حرارت خشک باشند. دمای لازم برای استریل کردن توسط فور 180 درجه و زمان آن حدود 3 ساعت می باشد. بعد از اتمام کار استریل کردن و قبل از باز کردن درب دستگاه باید توجه داشت که باید دستگاه سرد شده باشد تا از شکستن وسایل شیشه ای جلوگیری شود.
درجه حرارت داخل فور توسط یک دماسنج به تنظیم کننده حرارت(ترموستات) متصل می باشد و این دماسنج دما را به ما نشان می دهد.
بن ماری یا حمام آبی :
وسیله ای است که در آن بوسیله آب محتوی آن می توان حرارت معینی را ثابت نگهداشت که درجه حرارت تا 100 درجه قابل تنظیم می باشد که در این حالت به آن بن ماری جوش می گویند. از این دستگاه می توان بعنوان گرمخانه گذاری محیطهای کشت و همچنین ذوب نمودن محیطهای کشت هم استفاده نمود. بن ماری بهتر است حاوی دماسنج نیز باشد.
شعله گاز یا چراغ بونزن : شعله آزمایشگاهی وسیله ای برای حرارت دادن و سترون کردن لوازمی مانند سوزن کشت و دهانه ظروف و لوله های آزمایش و غیره و در واقع فضایی معادل 15 سانتیمتر اطراف خود را استریل و عاری از میکروب می نماید.
پتری دیش یا پلیت : ظروف شیشه ای یا پلاستیکی (یکبارمصرف) هستند که حاوی درب می باشند و جهت نگهداری محیطهای کشت و کشتهای میکروبی از آن استفاده می شود.
لوله آزمایش : وسیله ای شیشه ای و استوانه ای شکل در سایزهای مختلف جهت نگهداری و کشت دادن میکروب در محیطهای مایع و انجام عملیات رقیق سازی و امور دیگر کاربرد دارد .
لام : یک صفحه شیشه ای نازک با سایزهای استاندارد که عملیات گسترش میکروبی و رنگ آمیزی روی آن انجام می گیرد.
لامل : صفحه شیشه ای بسیار نازک با ابعاد مختلف استاندارد که روی لام قرار می گیرد و برای مطالعه لام زیر میکروسکوپ از لامل استفاده می شود.
هود: وسیله ای اتاقک مانند با حفاظ شیشه ای متحرک و دارای هواکش و سیستم روشنایی که بعضی ازآنها حاوی لامپ UV جهت استریل کردن هوای داخل آن در هنگام کار با عوامل میکروبی و محیطهای کشت داده شده ، می باشند.
جار بیهوازی : وسیله ای استوانه ای شکل و یزرگ ، حاوی درب مخصوص که جهت کشت میکروبهای بیهوازی در شرایط خلاء از آن استفاده می شود.
سوزن کشت یا آنس : وسیله ای با نوک تیز یا حلقوی برای برداشتن نمونه میکروبی و کشت آن برروی محیط کشت .
ظروف رنگ آمیزی : ظروف شیشه ای تیره رنگ با نوک قطره چکان دار جهت نگهداری رنگهای مورد استفاده در رنگ آمیزی های مختلف می باشد.
ترازوی آزمایشگاهی : وسیله ای برای توزین با دقتهای 1/. و01/. و 001/. و 0001/. در آزمایشگاه می باشد. ترازوهای با دقت بالا بعلت ظرافت و حساسیت باید از جریان هوا دور نگه داشته شده و در یک جای مسطح و محکم قرار داده شوند و جای آن حتما باید تراز باشد.
ظروف رنگ آمیزی : ظروف شیشه ای تیره رنگ با نوک قطره چکان دار جهت نگهداری رنگهای مورد استفاده در رنگ آمیزی های مختلف می باشد.
شیکر : جهت مخلوط کردن و هم زدن نمونه ها در لوله آزمایش و در نوع دیگر، شیکر با صفحه مسطح می باشد که برای هم زدن و مخلوط کردن محتویات ظروف با سطح مقطع پهن است .
سایر تجهیزات آزمایشگاه میکروبیولوزی :
بشر
، ارلن ، استوانه مدرج ، سوآپ ، قاشقک (اسپاچول) ، ترمومتر ، پیست ، ظرف
اتوکلاو ، آنس ، جالوله ای ، جا پلیتی ، لوله دورهام ، جعبه کمکهای اولیه ،
ظروف رنگ آمیزی ، میکروسکوپ
«ویژگی های میکروبیولوژی آب آشامیدنی»
ردیف
نوع آب
نوع باکتری
حد مجاز در 100 میلی لیتر
1
کلیه آب های آشامیدنی
اشرشیاکلی یا کلیفرم های گرما پای
منفی
2
آب تصفیه شده برای استفاده در سیستم توزیع
اشرشیاکلی یا کلیفرم های گرما پای
منفی
3
آب تصفیه شده موجود در سیستم توزیع
اشرشیاکلی یا کلیفرم های گرما پای
منفی
یادآوری1- در صورتی که اشرشیاکلی از نمونه آب جدا شود، باید بررسی و اقدام لازم انجام شود.
یادآوری2- با وجود اینکه اشرشیاکلی شاخص دقیق تری برای آلودگی مدفوعی می باشد، جستجوی باکتری های کلیفرم گرما پای نیز به عنوان جایگزین، قابل قبول می باشد، در صورت لزوم، آزمون های تاییدی مناسب باید انجام شود.
«ویژگی های باکتریولوژی آب اشامیدنی بسته بندی شده»
نوع میکروارگانیسم
بیشینه مجاز
روش آزمون
کل کلیفرم ها
منفی در صد میلی لیتر
طبق استاندارد ملی ایران 3759
اشرشیاکلی
منفی در صد میلی لیتر
طبق استاندارد ملی ایران 3759
میکروارگانیسم های قابل کشت در دمای 2±22
100 در هر میلی لیتر
طبق استاندارد ملی ایران 5271
میکروارگانیسم ها قابل کشت در دمای 2±36
20 در هر میلی لیتر
طبق استاندارد ملی ایران 5271
یادآوری 1- میکروارگانیسم های قابل کشت تنها در زمان بسته بندی و یا بیشینه دوازده ساعت پس از بسته بندی (در صورت نگه داری در دمای پنج درجه سلسیوس) می تواند مورد ملاک قرار گیرد.
«ویژگیهای باکتریولوژیکی آب معدنی»
ردیف
نوع باکتری
حجم نمونه
حد مجاز تعداد باکتری
1
کل کلیفرمها
پاسخ نمونه در 250cc
صفر در 100 میلی لیتر
2
کلیفرمهای مقاوم به گرما
" " " "
" " " " "
3
استرپتوککهای مدفوعی
" " " "
" " " " "
4
کلستریدیومهای احیاء کننده سولفیت
" " " "
" " " " "
5
سودوموناس
" " " "
منفی در 100 میلی لیتر
6
باکتریهای هوازی مزوفیل
24 ساعت در 20oc گرمخانه گذاری شده
حداکثر 20 عدد در یک میلی لیتر
7
" " "
24 ساعت در 37oc گرمخانه گذاری شده
حداکثر 100 عدد در یک میلی لیتر
« جدول حد استاندارد میکروبی آب معدنی»
حد مجاز شمارش کلی باکتری ها در مظهر چشمه (شمارش باکتری های هتروتروفیک)
دمای گرمخانه گذاری (درجه سلسیوس(
زمان گرمخانه گذاری )ساعت)
حداکثر تعداد مجاز در هر میلی لیتر
22-20
72
20
37
24
5
حد مجاز شمارش کلی باکتریها (حداکثر تا 12 ساعت پس از بطری شدن)
دمای گرمخانه گذاری (درجه سلسیوس(
زمان گرمخانه گذاری )ساعت(
حداکثر تعداد مجاز در هر میلی لیتر
22-20
72
100
37
24
20
حد مجاز آلودگی باکتریایی
آزمون اول
نوع میکروارگانیسم
حجم آزمون
تفسیر نتایج
روش استاندارد
اشرشیاکلی یا کلیفرم گرماپای
250*1
در هیچیک از نمونه ها نباید وجود داشته باشد
استاندارد ملی ایران به شماره های 3760-3759
کلیفرمهای غیر مدفوعی
250*1
در صورتیکه تعداد باکتری کمتر از 2 باشد، آزمون دوم باید انجام شود
استاندارد ملی ایران به شماره های 3760-3759
استرپتوککهای مدفوعی
250*1
در صورتیکه تعداد باکتری کمتر از 2 باشد، آزمون دوم باید انجام شود
استاندارد ملی ایران به شماره های 3619-3620
سودوموناس آئروژینوزا
250*1
در صورتیکه تعداد باکتری کمتر از 2 باشد، آزمون دوم باید انجام شود
استاندارد ملی ایران به شماره 3140
بی هوازی ها یا احیاء کننده سولفیت
50*1
در صورتیکه تعداد باکتری کمتر از 2 باشد، آزمون دوم باید انجام شود
در دست تدوین می باشد
..
آزمون دوم
n
تعداد نمونه مورد آزمون
نوع میکروارگانیسم/حداکثر تعداد
C
نمونه آلوده قابل قبول (1)
M
میکروارگانیسم در یک نمونه
m
میکروارگانیسم در سایر نمونه ها
4
کلیفرم های مدفوعی و غیر مدفوعی
1
2
0
4
استرپتوککهای مدفوعی
1
2
0
4
سودموناس آئروژینوزا
1
2
0
4
بی هوازی احیاء کننده سولفیت
1
2
0
1) نمونه آلوده قابل قبول: منظور حداکثر تعداد نمونه ای است که در آن شمارش باکتریها می تواند بین M و m باشد.
روشهای آزمایش
آیین‌کار آزمونهای باکتریولوژیکی آب
1- هدف
هدف از تدوین این آئینکار , ارائه یک راهنما 1 جهت انجام آزمونهای باکتریولوژیکی آب میباشد
این آئین کار شامل آماده سازی نمونه
و روشهای مختلف شمارش انواع میکروارگانیسمهاست .
2- دامنه کاربرد
این آئینکار در مورد آب آشامیدنی , آب معدنی بطری شده , آب استخر و شناگاههای طبیعی کاربرد دارد .
- مواد اولیه
به منظور بدست آوردن نتایج هماهنگ , لازم است از مواد اولیهای با کیفیت و درجه خلوص یکسان , استفاده نمود آب مورد مصرف نیز باید از نوع تقطیر شده با تجهیزات شیشهای 2 بوده و عاری از مواد بازدارنده از رشد میکروارگانیسمها باشد . در صورتی که آب مقطر از آب کلرینه شده تهیه میشود باید قبل از تقطیر ; کلر آن خنثی شود .
3-2- محیط کشت - برای آماده کردن محیطهای کشت دستورالعمل سازنده باید به طور دقیق رعایت شود . بسیاری از محیطهای کشت را میتوان پس از سترون شدن به صورت کاملا دربسته در دمای 22-18 درجه سلسیوس به مدت حداکثر 3 ماه نگه داری نمود . محیطهائی که تحت شرایط سترونی تقسیم و توزیع میشوند را میتوان در دمای 10-4 درجه سلسیوس حداکثر به مدت یک ماه نگهداری نمود . کلیه محیطهای کشت باید قبل از مصرف از نظر آلودگی , تبخیر زیاد و یا سایر نشانههای فساد کنترل شوند .
- سترونی
4-1- محیطهای کشت و محلولهای رقیق کننده - در اغلب موارد محیطها و محلولهای رقیق کننده پس از توزیع در ظروف مناسب در دمای 121±1 درجه سلسیوس (فشار 245 کیلو پاسکال) به مدت 15 دقیقه سترون میشود . در مواردی خاص میتوان طبق توصیه سازنده از دما و زمان مختلف استفاده نمود . در مورد محیطهائی که نسبت به حرارت ناپایدار هستند سترونی با استفاده از صافیهای سترون با اندازه روزنه حداقل 0/22 میکرون انجام میشود .
4-2- وسایل و تجهیزات - وسایل و تجهیزات فلزی , شیشهای و یا سایر ترکیبات مقاوم به حرارت به وسیله یکی از روشهای زیر سترون میشود .
4-2-1- دمای خشک - در دمای 160±2 درجه سلسیوس به مدت حداقل 1/5 ساعت و یا در دمای 170±2 درجه سلسیوس به مدت حداقل یک ساعت . 2-4-2- دمای مرطوب - در دمای 121±1 درجه سلسیوس (فشار 245 کیلو پاسکال به مدت حداقل 20 بیست دقیقه .
آمادهسازی نمونه
به منظور توزیع یکنواخت میکروارگانیسمها , باید قبل از آزمون نمونه را با تکان دادن ظرف , کاملا مخلوط نمود
. در صورتی که ظرف حاوی نمونه بصورت کامل پر میباشد , ابتدا مقداری از آن را تحت شرایط سترونی بیرون ریخته و سپس عمل مخلوط کردن را انجام دهید .
6- شمارش در محیط جامد
روش براساس برداشت حجم معینی از نمونه و تلقیح آن بر روی سطح و یا درون محیط کشت خاصی است . فرض براین است که پس از گرمخانهگذاری هر میکروارگانیسم تکثیر یافته و ایجاد پرگنه قابل مشاهده در محیط کشت میکند
. روش کار میتواند به سه صورت به شرح زیر باشد :
6-1- روش مخلوط کردن نمونه با محیط کشت درون پلیت - (پورپلیت) 4 روش براساس مخلوط کردن حجم معینی از نمونه و یا رقتی از آن با محیط ذوب شده تا دمای نزدیک به انجماد میباشد . پس از گرمخانهگذاری پرگنههای روی سطح محیط و یا درون آن شمارش میشود .
6-2- روش کشت سطحی - در این روش حجم معینی از نمونه یا رقتی از آن روی سطح محیط کشت حاوی آگار گسترده میشود و پس از گرمخانهگذاری کلیه پرگنههای روی سطح محیط شمارش میشود .
-3- روش صافی غشائی - روش براساس عبور دادن حجم معین نمونه از صافی است میکروارگانیسمها روی صافی باقی میماند سپس صافی روی محیط آگاردار و یا بالشتک جاذب 6 آغشته به محیط مایع قرار می‌گیرد . پس از گرمخانهگذاری , پرگنههای روی سطح صافیها شمارش میشود
. در مواردی که جستجوی میکروارگانیسمهای بی هوازی موردنظر است , ابتدا صافی درون پلیت قرار می‌گیرد (به گونهای که سطح چهارخانه آن به طرف پائین باشد). و سپس با محیط حاوی آگار ذوب شده پوشانیده میشود .
حداکثر حجم نمونه آزمایشی بستگی به قابلیت صاف شدن نمونه و صافی مورد استفاده دارد .
در مورد آب آشامیدنی حجم استاندارد برای صاف کردن نمونه 100/ میلی لیتر است . با صافیهائی با اندازه 0/45 میکرون
7 امکان صاف کردن چند لیتر آب وجود دارد که در این صورت روش آزمایش از حساسیت بالائی برخوردار است .
-3-2- انتقال صافی - پس از برداشتن صافی باکمک پنس سترون آن را به یک پلیت حاوی محیط آگار دار منتقل میکنیم
- گرمخانه گذاری
کلیه پلیتها را به صورت وارونه درون گرمخانه قرار داد .
زمان و دمای گرمخانه گذاری بسته به نوع میکروارگانیسم مورد جستجو متفاوت بوده و ممکن است در دو مرحله انجام شود . - شمارش
پس از پایان زمان گرمخانه گذاری پلیتها و صافیها را سریعأ مورد بررسی قرار دهید و در صورتی که امکان بررسی سریع آن نیست . میتوان پلیتها را در دمای 4 تا 5 درجه سلسیوس حداکثر به مدت 24 ساعت نگه داری نمود .
در مورد یک سری رقت متوالی پلیتی را شمارش کنید که بین 25 تا 300 پرگنه دارد .
برای محاسبه نتایج , از آنجا که هر پرگنه از یک میکروارگانیسم منشأ گرفته میتوان نتایج را به عنوان تعداد واحد پرگنه ساز 10 در حجم معین نمونه محاسبه نمود .
- شمارش و غنی سازی بوسیله تلقیح در محیط کشت مایع
روش براساس تلقیح حجم معینی از نمونه در محیط کشت مایع است تا از رشد میکروارگانیسمهای خاص اطمینان یابیم . کاربرد روش فوق در موارد زیر است .
10-1- آزمون برای وجود یا عدم وجود میکروارگانیسمها - پس از تلقیح حجم معین در محیط کشت مایع و گرمخانه گذاری , با پیدایش تظاهرات ناشی از رشد میکروارگانیسم میتوان به وجود یا عدم وجود آن در حجم معین نمونه پی برد .
10-2- آزمون برای غنی سازی - در مواردی که تعداد احتمالی باکتری در نمونه کم است و شمارش نیز مطرح نیست میتوان حجم معینی از نمونه را در محیط کشت مایع فاقد عوامل بازدارنده از رشد تلقیح نمائید . پس از گرمخانه گذاری آن را به محیط کشت انتخابی جامد منتقل کنید .
- آزمون برای شمارش - روش تخمین محتملترین تعداد .(N.P.M) 11
روش براساس نظریه احتمالات بوده و فرض براین است که میکروارگانیسمها با یک توزیع یکنواخت و به صورت انتخابی در نمونه پخش شدهاند
. پس از تلقیح حجمهای مختلف نمونه به لوله‌های حاوی محیط مایع و گرمخانه گذری , تغییرات ویژه ای ناشی از رشد باکتریها مانند کدورت , تولید گاز , تغییر PH ظاهر خواهد شد
. با در نظر گرفتن تعداد لوله‌های مثبت و با استفاده از جداول آماری میتوان بیشترین تعداد احتمالی باکتریها را تخمین زد .
- انتخاب روش
انتخاب روش آزمون آب به عوامل متعددی از جمله ویژگیهای فیزیکی - شیمیائی نمونه , و نوع میکروارگانیسم مورد جستجو دارد
. انتخاب روش در موارد مختلف به شرح زیر است .
11-1- در مواردی که آب حاوی ذرات معلق است , استفاده از روش صافی غشائی مناسب نمی‌باشد . (به علت مسدود شدن صافیها توسط ذرات معلق و حتی موجودات زنده مانند میکروپلانکتونها) مسدود شدن روزنه صافیها باعث کاهش عبور مواد غذائی از صافی شده و در نتیجه عدم تشکیل پرگنه میشود).
11-2- در مورد آبهای خیلی کدر روش .N.P.M تنها روشی است که میتوان استفاده نمود .
-4- در مواردی که مواد محلول در آب زیاد است استفاده از روش صافی غشائی توصیه میشود
11-5- در مواردی که احتمال وجود بیش از 100 پرگنه روی هر صافی وجود دارد استفاده از روش صافی غشائی از حساسیت لازم برخوردار نمی‌باشد .
11-6- در مواردی که تعداد میکروارگانیسمها در نمونه کم است ( کمتر از 100 عدد در هر میلی لیتر ) استفاده از روش کشت سطحی مناسب نمی‌باشد .
11-8- در مورد آبهای حاوی ذرات معلق استفاده از روش کشت ((مخلوط کردن نمونه با محیط کشت)) (پورپلیت) به دلیل شمارش ذرات به جای پرگنه و ((روش کشت سطحی )) به دلیل نداشتن حساسیت لازم مناسب نمی‌باشد .
11-10- به طور کلی روش .N.P.M به دلیل تخمینی بودن نسبت به روش شمارش در محیط جامد دارای دقت کمتری میباشد . توصیه میشود در صورت امکان به طور هم زمان از هر دو روش استفاده نمود .
جستجو و شمارش کلیفرم ها در آب به روش چند لوله ای
1 ـ هدف
هدف ارائه یک روش مرجع برای شناسائی و شمارش کلیفرمها , کلیفرمهای گرماپای و اشریشیاکلی فرضی در آب به وسیله کشت در محیط مایع به روش چند لولهای و محاسبه بیشترین تعداد احتمالی 4 آنها در نمونه میباشد .
2 ـ دامنه کاربرد
این استاندارد در مورد کلیه آبها , حتی آبهایی که دارای ذرات و مواد معلق هستند , کاربرد دارد .
ـ تعاریف
3 ـ 1 ـ کلیفرمها :
منظور میکروارگانیسمهایی هستند که میتوانند در شرایط هوازی در دمای35±0/5 و 37±0/5 درجه سلسیوس در محیط مایع لاکتوز رشد کرده و در مدت 48 ساعت تولید اسید و گاز کنند .
3 ـ 2 ـ کلیفرمهای گرماپای :
منظور کلیفرمهای تعریف شده در بند 3 ـ 1 هستند که قادرند در مدت 24 ساعت در دمای44±0/5 و44/5±0/25 درجه سلسیوس نیز تولید اسید و گاز کنند .
3 ـ 3 ـ اشریشیاکلی فرضی :
منظور کلیفرمهای مقاوم به حرارت تعریف شده در بند 3 ـ 2 هستند که قادرند در مدت 24 ساعت در دمای 44±0/5و 44/5±0/25درجه سلسیوس از تریپتوفان تولید اندول و از لاکتوز و مانیتول تولید گاز کند .
ـ اساس روش
4 ـ 1 ـ تلقیح نمونه یا رقتی از آن به یک سری لوله‌های حاوی محیط مایع انتخابی لاکتوز .
4 ـ 2 ـ گرمخانه گذاری لولهها در دمای 35 تا 37 درجه سلسیوس به مدت 24 تا 48 ساعت .
4 ـ 3 ـ تجدید کشت هریک از لوله‌های دارای کدورت و گاز مثبت به محیط انتخابی تأییدی .
4 ـ 4 ـ در مواردی که جستجوی اشریشیاکلی فرضی مورد نظر است , برای بررسی تولید اندول از لوله‌های فوق در یک محیط ترپتوفان دار کشت داده میشود .
در مورد بررسی کلیفرمها , محیطهای تأییدی در دمای 25 تا 37 درجه سلسیوس به مدت 48 ساعت قرار می‌گیرد و در مورد بررسی کلیفرمهای گرماپای و اشریشیاکلی فرضی در دمای 42 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاری میشود . سپس با استفاده از جداول آماری بیشترین تعداد احتمالی کلیفرمها , کلیفرمهای گرماپای و اشریشیاکلی فرضی در 100 میلیلیتر از نمونه محاسبه میشود . (از تعداد لولههایی که نتایج تأییدی مثبتی داشتهاند).
ـ روش کار
7 ـ 1 ـ آماده سازی :
آماده سازی و تهیه رقتهای مورد نیاز را برطبق استاندارد ملی ایران به شماره 356 انجام
7 ـ 2 ـ گرمخانه گذاری :
لوله‌های تلقیح شده را برای مدت 48 ساعت در دمای 35±0/5 یا37±0/5 درجه سلسیوس قرار دهید .
7 ـ 3 ـ بررسی :
پس از مدت 18 تا 24 ساعت لولهها را بررسی نمایید . لولههایی که دارای کدورت همراه با تولید گاز و اسید (در مورد محیطهایی که دارای معرف PH هستند) هستند , به عنوان نتیجه مثبت در نظر بگیرید
و لولههایی را که منفی بوده و یک یا تمامی تغییرات فوق را نشان نداده است , مجددا تا 48 ساعت در گرمخانه قرار دهید .
ـ 4 ـ آزمونهای تاییدی :
از آنجا که واکنش مثبت در لوله‌های حاوی جدا ساز 5 تنها مربوط به کلیفرمهای فرضی است , بنابراین انجام آزمون تأییدی بر روی محیط کشت انتخابی اهمیت داشته و ترجیحأ پرگنههای شاخص به مرحله آزمون تأییدی انتقال یابد
. از هر یک از لوله‌های واکنش مثبت در یک یا چند لوله حاوی محیطهای تأییدی) کشت دهید تا تولید اندول و گاز مورد بررسی قرار گیرد .
یادآوری 1: در صورتی که جهت جداسازی از محیط ساده آبگوشت لاکتوز استفاده میشود , توصیه می‌گردد
از دو محیط انتخابیتر تأییدی آبگوشت لاکتوز - صفرا - سبزدرخشان و اشریشیاکلی براث نیز استفاده شود .
ـ 4 ـ 1 ـ کلیفرمها :
برای تایید وجود کلیفرمها , توسط حلقه کشت از لوله‌های واکنش مثبت برداشت نموده و به لوله حاوی محیط آبگوشت لاکتوز - صفرا - سبزدرخشان تلقیح نمایید . لوله را در دمای 35 تا 37 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری نموده و پس از 48 ساعت از نظر تولید گاز بررسی کنید .
7 ـ 4 ـ 2 ـ کلیفرمهای گرماپای :
توسط حلقه کشت از لوله‌های واکنش مثبت برداشت نموده و به لوله حاوی محیط آبگوشت اشریشیاکلی تلقیح نمایید . لوله را در دمای 44 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری نموده و پس از 24 ساعت از نظر تولید گاز بررسی نمائید .
7 ـ 4 ـ 3 ـ اشریشیاکلی فرضی :
توسط حلقه کشت از لوله‌های واکنش مثبت بند 7 ـ 3 برداشت نموده و به لوله حاوی محیط آب تریپتونه تلقیح نمایید . سپس لولهها را به مدت 24 ساعت در دمای 44 درجه سلسیوس قرار دهید
. پس از پایان این مدت مقدار 0/2 تا 0/3 از معرف کواکس به لولهها اضافه نمایید . پس از تکان دادن لولهها , ایجاد رنگ قرمز دلیل بر حضور اندول است .
ـ 5 ـ آزمون اکسیداز : برخی از میکروارگانیسمهایی که در آب یافت میشوند , ممکن است در بسیاری از جهات مشابه با کلیفرمها باشند . این میکروارگانیسمها فقط در دمای کمتر از 37 درجه سلسیوس قادر به تخمیر لاکتوز و تولید گاز هستند ولی از نظر آزمونهای تأییدی منفی هستند و حضور آنها در آب حائز اهمیت نمی‌باشد .
گونههای آئروموناس نیز که به طور طبیعی در آب وجود دارند , فقط در دمای 37 درجه سلسیوس یا کمتر از لاکتوز تولید اسید و گاز میکنند و موجب تداخل در روند آزمون میشوند . این میکروارگانیسمهای اکسیداز مثبت بوده و قابل تشخیص از کلیفرمها میباشند .
7 ـ 5 ـ 1 ـ آزمون اکسیداز را با کشت خالص از باکتری تخمیرکننده لاکتوز که روی محیط آگار مغذی رشد کرده است , به صورت زیر انجام دهید .
- 2 یا 3 قطره از معرف اکسیداز را روی یک کاغذ صافی در یک پیلیت قرار دهید .
- با استفاده از یک میله شیشهای , سواب یا سوزن کشت پلاتینی (نیکل و کروم نباشد) مقداری از پرگنه را روی کاغذ صافی قرار دهید .
- ظهور رنگ ارغوانی مایل به آبی تیره در مدت 10 ثانیه را به عنوان واکنش مثبت درنظر بگیرید .
کیفیت آب- جستجو و شناسایی اشریشیا کلی و کلی فرم ها
قسمت اول : روش صافی غشایی
هدف ، تعیین روش آزمون شناسایی و شمارش اشریشیاکلی و کلی فرم ها در آب بوسیلة صافی غشایی به دو روش((سریع)) و ((استاندارد)) می باشد .
2 دامنه کاربرد
این استاندارد در مورد تمامی انواع آب به غیر از موارد زیر کاربرد دارد :
2-1 آب هایی که حاوی مقادیر قابل توجه ذرات و مواد معلق باشند، به گونه ای که در عمل صاف سازی ایجاد اختلال کند .
2-1 آب هایی که دارای تعداد زیادی از میکروارگانیسم های دیگر باشند، به گونه ای که رشد آنها مانع از شمارش دقیق کلیفرم ها شده و یا وجود آنها با فرایند صاف سازی تداخل ایجاد کنند .
اصطلاحات و تعاریف
در این استاندارد اصطلاحات و / یا واژه ها با تعاریف زیر به کار می رود :
4-1 باکتری های لاکتوز مثبت
(روش استاندارد)
منظور، باکتری هایی هستند که در شرایط هوازی در دمای 3 ± 36 درجه سلسیوس بر روی محیط کشت انتخابی و افتراقی دارای لاکتوز رشد نموده، در مدت 3 ± 21 ساعت تولید اسید کنند
4-2 کلیفرم ها
(روش استاندارد)
منظور، باکتری های لاکتوز مثبت تعریف شده در بند 4-1 است که اکسیداز منفی می باشند .
4-3 اشریشیا کلی
(روش استاندارد)
منظور، باکتری های کلی فرم تعریف شده در بند 4-2 است که در دمای 5/0 ± 44 درجه سلسیوس به مدت 3 ± 21 ساعت از تریپتوفان تولید ایندول کنند .
روش استاندارد
روش استاندارد براساس قرار دادن صافی غشایی بر روی محیط کشت انتخابی جامد لاکتوز دار و گرمخانه گذاری آن در دمای 3 ± 36 درجه سلسیوس بمدت 3 ± 21 ساعت می باشد .
کلنی های مشخص تشکیل شده در سطح صافی غشایی، بعنوان باکتری های لاکتوز مثبت شمارش می شود. پس از انتخاب کلنی های مشخص و تجدید کشت آن ها، آزمونهای تأییدی شامل تولید ایندول و همچنین آزمون اکسیداز انجام می گردد و سپس تعداد احتمالی باکتریهای کلی فرم و اشریشیاکلی در 100 میلی لیتر نمونه محاسبه می شود .
6 نمونه برداری
6-1 مقدار یک تا پنج لیتر آب را با رعایت شرایط زیر نمونه برداری کنید :
آب - جستجو و شناسایی کلیفرم ها به روش وجود -
عدم وجود - روش آزمون میکروبیولوژی
مقدمه
شناسایی باکتری های نشانگر یکی از بهترین راه ها برای ارزیابی کارائی روشهای تصفیة آب است . باکتر های کلیفرم به دلیل سرعت و سهولت جدا سازی و شناسایی ، شاخص میکروبی مناسبی برای تعیین کیفیت آب آشامیدنی هستند این باکتریها نباید در آب آشامیدنی تصفیه شده وجود داشته باشند . وجود باکتریهای کلیفرم در آب نشانگر فرآیند ناکافی و یا آلودگی پس از تصفیه است .
1- Presence- Absence (P-A) Coliform test .
یکی از روش های ساده برای شناسایی کلــیفرم ها در آب روش آزمون وجود - عدم وجود کلیفرم1 می باشد. این روش امکان آزمون تعداد زیادی از نمونه های آب را به طور همزمان فراهم می کند
4-1 کلیفرم ها
گروهی از باکتری های هوازی و بی هوازی اختیاری ، گرم منفی ، میله ای شکل و بدون اسپور هستند که قادرند در شرایط هوازی در محیط های کشت انتخابی لاکتوزدار در دمای 5/0 ± 35 درجه سلسیوس در مدت 24 تا 48 ساعت تولید اسید و گاز کنند .
اساس روش
این روش براساس تلقیح حجم معینی از نمونه آب به محیط انتخابی لاکتوز دار و گرمخانه گذاری در دمای 5/0 ± 35 درجه سلسیوس انجام می پذیرد . سپس با استفاده از محیط های کشت انتخابی و تائیدی ، وجود کلیفرم ها تائید می شود .
6 نمونه برداری
دست کم 500 میلی لیتر آب را (طبق استاندارد ملی 4208) سال 1376 آئین کار نمونه برداری از آب جهت آزمونهای باکتریولوژی نمونه برداری کنید .
7-1-1 آبگوشت P-A 1
1- P-A broth
2طرز تهیه :
ترکیبات فوق را با جوشاندن در آب مقطر حل نمائید . سپس به حجم های 50 میلی لیتر در ظروف شیشه ای با گنجایش 250 میلی لیتری ریخته ، و در اتوکلاو با دمای 1 ± 121 درجه سلسیوس به مدت 12 دقیقه سترون کنید . pH نهایی محیط باید 2/0± 8/6 باشد.
روش اجرای آزمون
9-1 تلقیح نمونه
نمونه مورد آزمــون را به مــدت 5 ثانــیه بشدت تکان دهید. سپس 100 میلی لیتر از آن را به 50 میلی لیتر محیط کشت آبگوشت P-A بند 7-1-1 با غلظت سه برابر تلقیح نموده و پس از یکنواخت شدن ، در دمای 5/0 ± 35 درجه سلسیوس به مدت 24 تا 48 ساعت گرمخانه گذاری نمائید .
9-2 بررسی نمونه
نمونه تلقیح شده بند 9-1 را پس از پایان زمان گرمخانه گذاری بررسی کنید . مشاهده رنگ زرد در محیط کشت آبگوشت P-A نشانگر تخمیر لاکتوز و تولید اسید و گاز همچنین حباب گاز
است. که با تکان دادن ظرف به آرامی حباب گاز و کف را می توانید در سطح آن مشاهده کنید. تولید اسید و گاز نشانگر وجود احتمالی کلیفرم ها در نمونه مورد آزمون می باشد که برای تائید آن باید آزمون تائیدی انجام پذیرد .
9-3 آزمون تائیدی
برای تائید وجود کلیفرم ها ، با استفاده از حلقه کشت سترون ، از کشت بند 9-2 که تولید اسید و گاز نموده اند ، برداشت نموده و به محیط کشت آبگوشت لاکتوز - صفرا - سبز درخشان بند
7-1-2 انتــقال داده و در دمای 5/0± 35 درجه سلسیوس به مدت 24 تا 48 ساعت گرمخانه گذاری نمائید. مشاهده گاز و کف در محیط فوق ، نشانگر وجود باکتری های کلیفرم در نمونه مورد آزمون می باشد .
10 بیان نتایج
نتایج را بصورت "" کلیفرم ها در 100 میلی لیتر نمونه آب وجود دارد "" و یا "" کلیفرم ها در 100 میلی لیتر نمونه آب وجود ندارد "" بیان کنید .
روش شمارش بیشترین تعداد احتمالی اشریشیاکلی با استفاده از MUG روش شمارش بیشترین تعداد احتمالی 1 اشریشیا کلی 2 با استفاده از (MUG) 3
1 - هدف
هدف از تدوین استاندارد ارائه روش براش شمارش اشریشیا کلی با استفاده از MUG میباشد . کلی فرمهای دیگر را نیز با این روش میتوان شمارش نمود .
- تعریف
3-1- اشریشیاکلی : در این استاندارد , منظور از اشریشیا کلی باکتری گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه است که میتواند در دمای 30 درجه سلسیوس ترکیب MUG را شکسته و ترکیبی با خاصیت فلوئورسانس ایجاد نماید .
این باکتری همچنین قادر به تولید اندول از تریپتوفان میباشد .
3-2- کلی فرمها : نام غیر رسمی برای تعدادی از باکتریهای گرم منفی که به خانواده انتروباکتریاسه تعلق دارند . در این استاندارد منظور از کلی فرمها , کلیه باکتریهای گرم منفی بدون اسپوری هستند که در درمای 30 درجه سلسیوس تا مدت حداکثر 48 ساعت میتوانند لاکتوز را تخمیر , گاز تولید نموده و نیز پرگنههای مشخص بر روی محیط جامد بند (6-2) ایجاد کنند .
- اساس و روش
ترکیب 4 - متیل آبلی فریل بتا - د - گلوکورونید توسط آنزیم بتا - د - گلوکورونیداز 4 شکسته شده و ترکیب حاصل متیل آمبلی فرون ماده است که زیر لامپ ماورای بنفش با طول موج 366 نانومتر خاصیت فلوئورسانس از خود نشان میدهد .
لامپهای ماورابنفش با طول موج کوتاه مناسب نمیباشند .
94 درصد از سویههای اشریشیاکلی این خاصیت را از خود نشان میدهند .
- آزمایش تولید اندول از تریپتوفان برای شناسایی اشریشیاکلی بر روی همان محیطی که حاوی MUG است انجام می‌گیرد .
روش آزمایش شمارش بشقابی
محیط کشت مورد نیاز نوترینت آگار می باشد. روش آزمایش به این ترتیب است که 1 میلی لیتر از نمونه مورد نظر را در پلیت استریل ریخته و 10 میلی لیتر از محیط کشت مورد نظر را به آن اضافه می کنیم و به صورت 8 پلیت را تکان می دهیم سپس محیط کشت را پس از جامد شدن به مدت 24 ساعت در انکوباسیون 35 درجه قرار می دهیم و پس از آن در صورت رشد کلنی ها آنها را روی کلنی کانتر قرار داده و شمارش کلنی ها را انجام می دهیم.
رنگ آمیزی گرم
معروفترین نوع رنگ آمیزی مرکب نوع گرم می باشد . این روش مفیدترین روش تشخیص باکتریها می باشد.
میکروبشناسی بنام کریتستیان گرم در سال 1884 بطور تصادفی واکنشی را کشف کرد که بعدها واکنش رنگ آمیزی گرم نامیده شد.
بر این اساس باکتریها با توجه با ساختمان دیواره یاخته ای (سلولی) به دو بخش بزرگ و کلی تقسیم می شوند: باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی . تفاوت عمده بین این دو گروه تفاوتهای ساختاری(ساختمانی) بین این دو گونه می باشد به این ترتیب که در گونه گرم مثبتها در دیواره سلولی نوعی پلی ساکارید بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی ضخیم تر می باشد در صورتیکه در دیواره سلولی نوع گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی نازکتر از نوع گرم منفی می باشد.
بر همین اساس در رنگ آمیزی گرم با توجه به این تفاوت مهم در دیواره سلولی ، از دو نوع رنگ استفاده می شود ، رنگ اولیه کریستال ویوله می باشد . هنگامیکه محلول کریستال ویوله به گسترش باکتریایی اضافه می شود این رنگ با ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی ترکیب شده و کمپلکس کریستال ویوله – ریبونوکلئات را بوجود می آورد و بعد از شستشوی رنگ اضافی ، محلول ید را بکار می برند . این محلول ید که ترکیبی فلزی می باشد به رنگ متصل شده و یک ترکیب رنگی غیر محلول ایجاد می کند بنام کمپلکس کریستال ویوله –ید که در سر دیگر آن متصل شده به ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی و تشکیل کریستال ویوله – ید – ریبونوکلئات داده است در حالیکه در باکتریهای گرم منفی چنین کمپلکسی ایجاد نمی شود. این پیوند در باکتریهای گرم مثبت بسیار پایدار است و در مرحله بعدی توسط ماده رنگ بر شکسته نمی شود و رنگ بنفش کریستال ویوله را در خود حفظ کرده بنابراین باکتریهای گرم مثبت زیر میکروسکوپ بنفش رنگ دیده می شوند.
از طرفی در دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته است بنابراین چربیها در الکل استن که در مرحله بعدی بعنوان رنگ بر بکار می روند ، محلول هستند و در اثر این واکنش چربیها از دیواره سلولی خارج شده و در اثر شستشو با حلال رنگ بر ، رنگ کریستال ویوله هم از سطح باکتری خارج می شود . با خروج چربی توسط ماده رنگ بر ، بر اندازه منافذ دیواره سلولی افزوده شده که این امر باعث بی رنگ شدن سریع باکتریهای گرم منفی می شود .در این مرحله باکتریهای گرم منفی از کریستال ویوله پاک می شوند . بنابراین بعد از شستشو توسط آب و افزوده شدن رنگ دوم یعنی سافرانین (فوشین) ، این رنگ به دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی جذب شده و باکتریها به رنگ قرمز در می آیند و در بررسی میکروسکوپی ، باکتریهای گرم منفی برنگ قرمز دیده می شوند.
اکثر باکتریهای موجود ، گرم منفی هستند البته بعضی از باکتریها ، مخمرها و تعدادی از کپکها گرم مثبت هستند.
بنابراین مراحل رنگ آمیزی گرم را می توان به شرح زیر بیان نمود:
1- تهیه گسترش روی لام : ابتدا از نمونه باکتری یک گسترش روی لام تهیه می کنید.
2- رنگ آمیزی با کریستال ویوله : در این مرحله مقداری از رنگ کریستال ویوله را با قطره چکان به روی سطح گسترش میکروبی روی لام بریزید و بگذارید 1 دقیقه بماند تا رنگ در دیواره سلولی میکروبها نفوذ کند.
3- مرحله شستشو: پس از سپری شدن مدت زمان 1 دقیقه ، رنگ اضافی روی لام را خالی کرده و با استفاده از آب مقطر سطح روی گسترش را شستشو دهید.
4- مرحله اضافه کردن محلول ید : جند قطره از محلول ید را روی گسترش پخش نموده و بگذارید بمدت 1 دقیقه به همان حالت بماند . بعد محلول اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو دهید.
5- مرحله رنگ بری با استفاده از استن – الکل : لام را با زاویه 45 درجه نگهدارید بعد با استفاده از محلول رنگ بر الکل – استن که بر روی گستره می ریزید بسرعت آنرا بی رنگ کنید. دقت کنید مرحله بی رنگ سازی بیش از اندازه نباشد. بعد از آن لام را بسرعت بشوئید . این عمل ، بی رنگ شده را متوقف خواهد کرد.
6- رنگ آمیزی با سافرانین : در این مرحله سطح گسترش را با رنگ ثانویه یعنی سافرانین بپوشانید و 30 تا 60 ثانیه صبر کنید . بعد از آن رنگ اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو دهید.
7- لام رنگ آمیزی شده را آهسته روی کاغذ خشک کن قرار دهید ولی کاغذ را روی گسترش نکشید.
نکات مهم :
1- حرارت بیش از اندازه هنگام تثبیت گسترش باعث پاره شدن دیواره سلولی باکتری شده . بنابراین باکتری گرم مثبت رنگ اولیه (کریستال ویوله) را هنگام رنگ بری از دست می دهد و رنگ ثانویه را جذب می نماید و در نتیجه باکتری گرم مثبت ، بصورت گرم منفی دیده می شود.
2- اگر گسترش ضخیم باشد هنگام مرحله بی رنگ شدن ، ممکن است مانند یم گسترش معمولی رنگ نشود و این مسئله باعث خطا در تشخیص شما در گرم منفی یا مثبت بودن باکتری خواهد شد.
3- غلظت درست و تازه بودن رنگها هم در رنگ آمیزی موثر است .
4- رنگ بری بیش از حد ممکن است باعت پاره شدن جدار باکتریهای گرم مثبت شده در نتیجه این باکتریها رنگ کریستال ویوله خود را از دست داده و رنگ ثانویه را جذب می نماید و بصورت گرم منفی دیده می شود.
5- دقت شود هنگام تهیه گسترش روی لام از محیط کشت ، سن کشت باکتری باید 24 ساعت یا کمتر باشد . بنابراین در محیط کشتهایی که از عمر آنها گذشته و کهنه شده اند ، در قابلیت نفوذ دیواره سلولی باکتریها تغییراتی حاصل می شود که خاصیت گرم مثبت بودن را از دست می دهد.
در رنگ آمیزی گرم مثبت باکتریها را به 5 گروه تقسیم بندی می کنند:
1- میله ای (باسیل ) گرم مثبت 2- میله ای گرم منفی 3- کوکوس (گرد) گرم مثبت 4- کوکوس گرم منفی 5- باکتریهای بدون واکنش به رنگ آمیزی گرم.
در این رنگ آمیزی می توان هر باکتری ناشناخته ای را در یکی از این 5 گروه قرار داده و با اطمینان 4 گروه دیگر را حذف کرد و به مطالعه در مورد آن باکتری پرداخت .
خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی :
1- باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.
2- گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود . پس هنگام تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت . یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم متبت ، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.
3- باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .
4- باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری و هضم و متلاشی شده آن می شوند.
طرز تهیه رنگها و محلولهای گرم :
1- کریستال ویوله :
- کریستال ویوله 2 گرم
- اتانول 95% 20سی سی
- اگزالات آمونیوم(خالص) 8/.گرم
- آب مقطر 80سی سی
کریستال ویوله را در اتانول حل کنید. اگزالات آمونیوم را در آب حل کنیدو سپس دو محلول را روی هم ریخته و بخوبی مخلوط کنید.
2- محلول ید:
- ید 1 گرم
- یدور پتاسیم 2 گرم
- آب مقطر 300 سی سی
ید و یدور پتاسیم را با هم در هاون بسائید تا کاملا نرم شود . مقدار کمی آب اضافه کنید تا محتویات هاون شسته شود. بقیه آب را هم اضافه کرده و کاملا مخلوط کنید . این محلول را باید در شیشه تیره رنگ نگداری کنید.
3- محلول سافرانین :
- سافرانین 25 گرم
- اتانول 95% 10سی سی
- آب مقطر 100سی سی
سافرانین را در اتانول حل کنید . آب مقطر را اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را از کاغذ صافی عبور دهید.
4- محلول استن – الکل :
- اتانول 95% 70 سی سی
- استن 30سی سی
دو محلول را کاملا با هم مخلوط کنید.
شمارش بشقابی HPC
تعداد کلنی های باکتریایی داخل یا روی محیط های جامد حاوی ترکیبات آلی نظیر منابع انرژی و کربن اطلاعاتی را درمورد غلظت و تراکم باکتریهای هتروتروفیک قابل کشت در آب و یا دیگر محیط های مورد بررسی به ما می دهد. این مورد به عنوان شمارش بشقابی هتروتروفیک (HPC) خوانده می شود که در ابتدا توسط کخ در سال 1881 مورد استفاده قرار گرفت و اولین ابزار نشان دهندة کیفیت میکروبی آب (تصفیه شده ) بود. چند سال بعد این روش در تعدادی از کشورهای اروپایی به کار گرفته شد.
در آغاز قرن بیستم روش ها و محیط های متعددی
جهت تشخیص شاخص های باکتریایی مدفوعی ابداع شد. اما شیوع
کریپتوسپوریدیوزیس میلواکی در سال 1993 مشخص نمود که عدم وجود کلیفرمها
همیشه نمی تواند بیانگر اطمینان از سلامت میکروبی آب باشد. مقادیر HPC می
تواند اطلاعاتی را در مورد میزان فعالیت میکروبی در آب ارائه نماید و
بنابراین می تواند جهت کنترل و بهینه سازی فرآیندهای تصفیه و روشها و
فعالیتهای مهندسی مربوط به تصفیه و توزیع به کار رود.
باکتریهای
هتروتروف گروهی میکروارگانیسم هستند که قادر به سنتز همه مواد مغذی مورد
نیاز خود نمی باشند و لذا به منابع خارجی مواد آلی و غیر آلی جهت تغذیه
وابسته می باشند. تعداد قابل توجهی از باکتریهایی که در سیستم های آب
آشامیدنی می باشند از جمله باکتریهای هتروتروف می باشند. HPC را نمی توان
به عنوان یک شاخص در شناخت نوع میکروارگانیسم موجود به کار برد. در ضمن
نتایج HPC یک ارزیابی دقیق از تراکم و غلظت کل باکتریهای هتروتروف نمی باشد
و نتایج آن می تواند بیانگر ارگانیسم های قابل کشت موجود باشد. ترکیب و
تراکم گونه های باکتریایی که در آزمایش HPC بازیابی می شوند متفاوت بوده و
به فاکتورهای متعددی از جمله مشخصات فیزیکی و شیمیایی آب بستگی دارد.
اختلاف در شمارش و نوع ارگانیسم های موجود در نمونه های یکسان از یک مکان
نیز به وقوع می پیوندد. میکروارگانیسم های بازیابی شده در تست HPC می تواند
شامل ارگانیسم هایی باشد که به طور طبیعی در آب و محیط وجود دارند و یا
ارگانیسم هایی که از منابع آلاینده مختلف وارد می شوند.
باکتریهای هتروتروف مجموعه ای از باکتریهای هوازی و بیهوازی اختیاری هستند که به جز دو جنس آن باسیلوسو میکروکوکوس گرم منفی بوده و جنس های پروتئوس، انتروباکتر،آئروموناس، سیتروباکتر، سودوموناس، کلبسیلا، فلاوباکتریوم، سراشیا، موراکسلا، الکالی ژنز و آسینتوباکتر را شامل می شوند. جنس های غالب این مجموعه، باکتریهای سودوموناس، سراشیا، انتروباکتر، فلاوباکتریوم و آسینتوباکتر هستند . علاوه بر جنس های یاد شده، برخی از باکتریهای مهم در پزشکی نظیر: مایکوباکتریوم، استافیلوکوکوس و سراشیا نیز در ترکیب باکتریهای هتروتروف ممکن است حضور داشته باشند. باکتریهای هتروتروف ساکن طبیعی بدن انسان و حیوانات بوده و از طریق مدفوع دفع می شوند. برگ درختان ، خاک ، آب ، قطره های باران و حتی بزاق دهان نیز تعداد متنابهی از این باکتریها را در خود جای داده اند. هر اینچ مربع از پوست سالم انسان، میزبان صدها هزار باکتری هتروتروف است. این باکتریها در بستر های کربن فعال، رزین ها، صافی های ماسه ای و غشایی ، شبکه های توزیع و اجزای آن، خنک کننده ها، مخازن تحت فشار و حتی جدار بطری های آب وجود دارند.بعضی از اعضای این گروه ، مانند سودوموناس ، آئروموناس ، کلبسیلا ، فلا ووباکتریوم ، انتروباکتر ، سیتروباکتر، سراشیا، اسینتوباکتر و پروتئوس از جمله پاتوژنهای فرصت طلب بوده و جمعیت خاصی چون نوزادان و افراد مسن و بیمار را در معرض خطر عفونت قرار می دهد. اما در مورد تأثیرات تعداد زیاد باکتریهای HPC روی سلامتی انسان اطلاعات اندکی در دسترس می باشد. در آبهای آشامیدنی تعداد باکتریهای HPC ممکن است کمتر از CFU 1 تا بیش از CFU 104 در میلی لیتر متغیر باشد و عمدتاً متأثر از درجه حرارت ، وجود کلر باقیمانده و میزان مواد آلی قابل جذب[1] می باشند. میزان HPC نباید از 500 ارگانیسم در میلی لیتر بیشتر باشد. با توجه به موارد زیر، HPC جهت اپراتورهای واحدهای تصفیه آب مفید می باشد.
1- ارزیابی کارایی فرآیندهای مختلف تصفیه ، از جمله گندزدایی، در یک واحد تصفیه آب
2- پایش کیفیت بیولوژیکی آب خروجی از تصفیه خانه در طی ذخیره و توزیع آن
3- تعیین رشد باکتریایی روی سطوح مواد مورد استفاده در سیستمهای تصفیه و توزیع
4- تعیین قابلیت رشد مجدد یا رشد بعدی در آب تصفیه شده در سیستم های توزیع
به طور کلی تعداد شمارش شدة باکتریهای هتروتروف به نوع محیط کشت ، زمان و دمای انکوباسیون و سرانجام روش کشت آن ها وابسته بوده و با افزایش دما و زمان انکوباسیون تعداد شمارش دهندة آن ها افزایش می یابد.کربن آلی قابل جذب (AOC ) به ویژه در غلظت های بیش از 15 میکروگرم در لیتر، باقیمانده عامل گندزدا در آب، جنس شبکه، دما، کدورت و تعداد اولیه باکتریهایی که از طریق تصفیه خانه وارد شبکه می شوند عامل های اثرگذار بر نرخ رشد جمعیت میکروبی در خطوط آبرسانی محسوب می شوند. انجمن کارهای آبی ایالات متحده (AWWA) شرایط مناسب برای رشد باکتریهای هتروتروف را در مقادیر بیش از 50 میکروگرم در لیتر AOC ، دمای بالاتر از 10 درجه سانتیگراد و کلر باقیمانده آزاد کمتر از 2/0 میلی گرم در لیتر دانسته است . بر طبق اعلام سازمان حفاظت محیط زیست ایالات متحده (EPA) حداکثر تعداد مجاز HPC در شبکه توزیع CFU/100ml 500 است و در صورتی که این مقدار به 1500 کلنی در هر میلی لیتر فزونی یابد، نشانة نقص در تأسیسات آبرسانی و به احتمال نیاز به شستشوی شبکه و مخزن است.
http://www.environmentalhealth.ir
جهت اطلاع از مطالب به روز سایت به کانالهای ما در شبکه های اجتماعی بپیوندید.
جهت اطلاع از مطالب به روز سایت به کانالهای ما در شبکه های اجتماعی بپیوندید.